楊梅果實(shí)維生素C與游離氨基酸含量的相關(guān)性分析

張啟，梁森苗，王嶸，林瑞，胡佳卉，鄭錫良，戚行江，張淑文*

(1.蘭溪市經(jīng)濟(jì)特產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江 金華 321102；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021)

楊梅是楊梅科楊梅屬小喬木，是我國(guó)南方著名的特色經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，主產(chǎn)浙江、江蘇、福建、江西、廣東、廣西等地，具有較高的營(yíng)養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。氨基酸是蛋白質(zhì)的組分，是許多重要合成途徑的前體物質(zhì)，是影響食品風(fēng)味的重要因素，具有甜、苦、酸、澀、鮮等味感，從而形成了風(fēng)味迥異的食物[1-2]。氨基酸種類(lèi)、含量及其組成成分的比例是影響食品營(yíng)養(yǎng)的關(guān)鍵因子，也是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[3]。目前氨基酸含量的測(cè)定主要有茚三酮比色法[4]、液相色譜法[5-6]、氨基酸儀分析法[7]等，比色法操作簡(jiǎn)便，但是只能檢測(cè)個(gè)別種類(lèi)氨基酸，生成產(chǎn)物容易不穩(wěn)定；高效液相色譜法雖然高效通用，但靈敏度低；氨基酸分析儀采用柱后衍生化系統(tǒng)具有選擇性高、針對(duì)性強(qiáng)，分析速度快、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。戴宏芬等[8]利用柱前衍生反相高效液相色譜法在4個(gè)楊梅品種果實(shí)檢測(cè)到可統(tǒng)計(jì)的14種氨基酸。張澤煌等[9-10]利用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)不同楊梅品種果實(shí)的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)楊梅果實(shí)氨基酸種類(lèi)豐富，共檢測(cè)到17種游離氨基酸，且不同種間氨基酸含量差異較大。

維生素C(VC)是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，人體只能從果蔬中攝取。VC由于其高效的抗氧化性，在人類(lèi)機(jī)體的健康發(fā)育及預(yù)防眾多疾病中發(fā)揮著不可或缺的作用[11]。迄今，植物體內(nèi)較公認(rèn)的4條VC合成途徑包括：L-半乳糖途徑(D-甘露糖途徑)、D-半乳糖醛酸途徑、古洛糖酸途徑和肌醇途徑[12]，但楊梅中VC合成途徑尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以13份楊梅種質(zhì)為試驗(yàn)材料，測(cè)定其VC等果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)和游離氨基酸含量，對(duì)品質(zhì)和氨基酸相關(guān)性進(jìn)行分析，明確果實(shí)游離氨基酸與品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)，為楊梅果實(shí)VC合成途徑研究提供新參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采集到13份楊梅種質(zhì)，文中依次用編號(hào)YM1、YM2、YM3、YM4、YM5、YM6、YM7、YM8、YM9、YM10、YM11、YM12、YM13對(duì)應(yīng)表示，其中，YM12為東魁，YM13為荸薺種，其余均為蘭溪市地方種質(zhì)，暫未命名。在果實(shí)成熟期隨機(jī)采摘無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)均勻的果實(shí)若干，放入保鮮盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮冷凍后，-80 ℃保存，用于氨基酸和果實(shí)品質(zhì)測(cè)定。13份楊梅果實(shí)采摘地、顏色、樹(shù)體特性如表1所示。

表1 楊梅種質(zhì)信息

1.2 試劑與儀器

主要試劑：鹽酸、苯酚、不同pH和離子強(qiáng)度的洗脫緩沖液，蒸餾水，乙腈，茚三酮溶液。17種氨基酸溶液混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別為天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴(lài)氨酸(Lys)。

主要儀器：日立LA-8080全自動(dòng)氨基酸分析儀、氮?dú)鉂饪s儀、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、紫外分光光度計(jì)、游標(biāo)卡尺。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氨基酸測(cè)定樣品前處理

樣品前處理參照國(guó)家《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》(GB 5009.124—2016)。將保存于-80 ℃冰箱的楊梅果實(shí)，用液氮研磨成粉末，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g試樣置于水解管中，加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液，3～4滴苯酚，將水解管放入冷凍劑中3～5 min或液氮冷凍至一半結(jié)冰，抽真空(接近0 Pa)，充氮?dú)?，重?fù)抽真空-充氮?dú)?次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)封口。將已封口的水解管放置在(110±1)℃的電熱鼓風(fēng)恒溫箱中，水解22～24 h，取出冷卻至室溫。

打開(kāi)水解管，將水解液過(guò)濾至50 mL容量瓶中，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一個(gè)100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取5 mL濾液移入10 mL試管內(nèi)，用濃縮儀在40～50 ℃加熱環(huán)境下減壓干燥，干燥后殘留物用水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。將0.02 mol·L-1鹽酸緩沖溶液加入到干燥后的試管內(nèi)振蕩溶解，渦旋混勻后，吸取溶液過(guò)膜，供儀器測(cè)定用?；旌习被針?biāo)準(zhǔn)溶液和樣品測(cè)定液分別注入氨基酸分析儀，以外標(biāo)法通過(guò)峰面積計(jì)算樣品測(cè)定液中氨基酸的濃度。

1.3.2 氨基酸測(cè)定方法

磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂分離柱(4.6 mm×60.0 mm)，柱溫57.0 ℃，反應(yīng)器溫度135 ℃，泵A(洗脫溶液)流速為0.40 mL·min-1，泵B(茚三酮溶液)流速為0.35 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，重復(fù)3次；檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm和440 nm。

1.3.3 果實(shí)品質(zhì)測(cè)定方法

每份種質(zhì)資源選取15個(gè)果實(shí)，用電子天平稱(chēng)量單果質(zhì)量，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)縱徑和橫徑(測(cè)量部位為果實(shí)中心處十字交叉)，計(jì)算果形指數(shù)=縱徑/橫徑，總糖、檸檬酸、VC含量使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒，采用分光光度法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)和相關(guān)性分析，使用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著分析(P<0.05)，采用Excel 2013進(jìn)行表格制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種質(zhì)楊梅果實(shí)品質(zhì)分析

由表2可以看出13種不同種質(zhì)楊梅單果重相差較大，單果重在4.38～16.69 g，其中YM12最大，YM9最小，YM12與其他各組組間差異顯著。果實(shí)縱徑大小在20.65～28.78 mm，橫徑范圍為20.86～29.2 mm，YM12最大，YM9最小。果形指數(shù)是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)之一，果形指數(shù)在0.94～1.13。總糖含量最高的為YM2，高達(dá)121.26 mg·g-1，最低為YM6，含量為61.67 mg·g-1。果實(shí)中酸成分及含量對(duì)果實(shí)品質(zhì)有很大的影響，不同楊梅種質(zhì)果實(shí)檸檬酸含量在9.28～14.47 g·kg-1，其中YM12含量最高，YM13最低。不同種質(zhì)間VC含量差異明顯，在409.5～986.7 mg·kg-1，含量豐富。

2.2 楊梅果實(shí)中游離氨基酸含量分析

本次試驗(yàn)對(duì)楊梅果實(shí)進(jìn)行了游離氨基酸定性和定量分析，共檢測(cè)出17種游離氨基酸，可統(tǒng)計(jì)的有16種(色氨酸在酸水解過(guò)程中容易被降解，故未檢測(cè)出，半胱氨酸由于是含硫氨基酸，酸解條件下檢測(cè)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，未統(tǒng)計(jì))。如表3所示，果實(shí)總游離氨基酸(total free amino acid,TFAA)變化范圍為4.13～7.55 mg·mL-1，平均為 5.26 mg·mL-1，YM12含量最高為7.55 mg·mL-1，顯著高于其他楊梅品種，其次是YM13，總游離氨基酸含量最低的是YM10為4.13 mg·mL-1。楊梅中包括8種人體必需氨基酸(essential amino acid,EAA)，分別為賴(lài)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，其中組氨酸為嬰幼兒所必需。必需氨基酸含量在1.70～2.71 mg·mL-1，占總游離氨基酸的35.75%～45.14%。必需氨基酸中含量最高的為賴(lài)氨酸，最大占比為22.48%，賴(lài)氨酸平均占必需氨基酸總量的21.70%，其次為亮氨酸，平均值為19.35%。其他8種為人體非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)，這類(lèi)氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天門(mén)冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸等，介于2.37～4.73 mg·mL-1，占總游離氨基酸的 55.08%～64.25%。非必需氨基酸中含量最高的為天冬氨酸，最大占比為37.09%。天冬氨酸與非必需氨基酸百分比的平均值為24.74%，其次是谷氨酸為21.73%。

表2 不同種質(zhì)楊梅果實(shí)常規(guī)品質(zhì)分析

表3 不同品種楊梅果實(shí)游離氨基酸組分含量 單位：mg·mL-1

楊梅果實(shí)中還包括一些特殊氨基酸，如藥用氨基酸(medicinal amino acid,MAA)、呈味氨基酸(taste-active amino acid,TAA)等。MAA是植物中含量少，人體不能完全合成，但又是維持機(jī)體氮平衡所必需的，包括天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸等9 種[13]。楊梅果實(shí)中藥用氨基酸含量范圍在2.59～4.63 mg·mL-1，均值為3.35 mg·mL-1，YM12含量最大為4.63 mg·mL-1，其次是YM6為4.24 mg·mL-1。TAA包括天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸等6種，能使食物呈現(xiàn)出特殊的風(fēng)味。楊梅TAA含量1.92～3.67 mg·mL-1，YM12含量最高為3.67 mg·mL-1，其次是YM6為3.36 mg·mL-1。TAA含量占總游離氨基酸的43.63%～54.11%，平均占比為48.43%，YM6占比最大，YM1最小(表4)。

表4 不同品種楊梅果實(shí)游離氨基酸組分比例 單位：%

2.3 果實(shí)氨基酸與VC含量相關(guān)性分析

對(duì)不同氨基酸與VC含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)如表5所示，楊梅果實(shí)游離氨基酸與VC含量間均為負(fù)相關(guān)關(guān)系；除酪氨酸、天冬氨酸、組氨酸之外，其余氨基酸及總游離氨基酸含量與VC含量之間呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，其中，脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸與VC含量之間呈極顯著性負(fù)相關(guān)。

表5 果實(shí)氨基酸與VC含量間的相關(guān)性分析

3 討論

氨基酸是果實(shí)品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值重要因素之一，也成為評(píng)價(jià)品質(zhì)的一個(gè)重要方面。果實(shí)品質(zhì)受樹(shù)體生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程營(yíng)養(yǎng)狀況和環(huán)境條件等因素的影響，可通過(guò)選育優(yōu)良品種、提高植株?duì)I養(yǎng)狀況和改善生長(zhǎng)環(huán)境等手段提升營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。本研究測(cè)定了13份楊梅種質(zhì)果實(shí)VC等品質(zhì)指標(biāo)和氨基酸含量，結(jié)果表明：必需氨基酸中賴(lài)氨酸和亮氨酸含量占比最大，非必需氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸占比最大，與朱奕凡等[10]研究結(jié)果相似。同時(shí)，YM6的呈味氨基酸和藥用氨基酸占總游離氨基酸的比重最大，其風(fēng)味更濃郁，可作為風(fēng)味種質(zhì)資源進(jìn)行利用。楊梅種質(zhì)間VC含量差異較大，其中，YM10含量最高，可作為高VC含量種質(zhì)進(jìn)行利用。本研究中利用的種質(zhì)資源具有不同的品質(zhì)特性，可根據(jù)不同目標(biāo)開(kāi)展種質(zhì)創(chuàng)新、雜交選育、功能基因挖掘等工作。楊梅果實(shí)中MAA占總游離氨基酸的百分比為61.16%～68.44%，平均值為63.63%，高于紅棗[14-15]，石斛[16]，低于枇杷[17]、枸杞[18]，可為楊梅保健食品開(kāi)發(fā)提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

對(duì)品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析的方法在農(nóng)業(yè)科研領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，徐陽(yáng)等[19]研究了紅美人柑橘果實(shí)大小與風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)性；鄭浩等[20]明確了不同成熟度橄欖果實(shí)表觀性狀與內(nèi)在品質(zhì)的變化和相關(guān)性；劉聰?shù)萚21]以蜜瓜為試材，研究不同貯藏溫度對(duì)其采后果實(shí)質(zhì)構(gòu)特性、理化指標(biāo)、感官品質(zhì)變化及相關(guān)性分析。大量研究分析了品質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)度，而關(guān)于品質(zhì)性狀，尤其是VC含量與氨基酸之間相關(guān)性分析研究較少，本研究探析了楊梅種質(zhì)資源果實(shí)VC與游離氨基酸含量間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸與VC含量之間呈極顯著性負(fù)相關(guān)。精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、總游離氨基酸與VC含量之間呈顯著性負(fù)相關(guān)，推測(cè)楊梅果實(shí)VC與上述游離氨基酸合成途徑的調(diào)控機(jī)制間可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因此，我們可開(kāi)展楊梅果實(shí)VC與極顯著負(fù)相關(guān)的游離氨基酸合成通路研究，明確不同通路間的共同因子和調(diào)控關(guān)系，再通過(guò)外源施加或其他有效措施，提高楊梅果實(shí)VC與游離氨基酸含量，提升果實(shí)品質(zhì)。