血液中乙醇測(cè)定影響因素探討

張棲瀝

(玉溪明鏡司法鑒定中心，云南 玉溪 653100)

血液中乙醇的測(cè)定，經(jīng)歷不斷地發(fā)展和完善，目前常用于司法鑒定機(jī)構(gòu)中的方法是頂空-氣相色譜法。頂空-氣相色譜法，是在氣相色譜儀進(jìn)樣口前增加一個(gè)頂空進(jìn)樣裝置(分為手動(dòng)和自動(dòng))的一種色譜技術(shù)，也常被解釋為將頂空進(jìn)樣器與氣相色譜儀聯(lián)用的儀器。其工作原理是以氣體作為流動(dòng)相，樣品由微量注射器“注射”進(jìn)入進(jìn)樣器，氣化后被載氣攜帶進(jìn)入填充色譜柱或毛細(xì)管柱。由于樣品中各組分在色譜中的流動(dòng)相(氣相)和固定相(固相)間分配或吸附系數(shù)的差異，各組分在兩相間做反復(fù)多次分配，使各組分在柱中得到分離，在色譜柱后的檢測(cè)器將各組分按順序檢測(cè)出來(lái)。頂空氣相色譜分析相比普通色譜分析主要有以下優(yōu)點(diǎn)：一、廣泛使用，范圍更廣。既可分析液體樣品中的揮發(fā)性組分，也能分析固體樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)；既適用于單組分揮發(fā)性氣樣的分析，也能對(duì)組成復(fù)雜的揮發(fā)性組分混合物進(jìn)行分離分析；既能用于常量頂空氣樣分析，又能檢測(cè)低含量的揮發(fā)性組分。二、快速簡(jiǎn)便、進(jìn)樣準(zhǔn)確。頂空氣相色譜分析直接取液體樣品(或固體樣品)的揮發(fā)性氣態(tài)樣品送進(jìn)氣相色譜儀進(jìn)行分離分析。在很多情況下，可以省去樣品前處理操作，人為干擾因素少，故此法要比普通的色譜分析更為快速簡(jiǎn)便。另外，由于采用定量管進(jìn)樣，分析更準(zhǔn)確。三、低檢測(cè)限、重現(xiàn)性好。頂空氣相色譜分析有時(shí)還可獲得比普通氣相色譜分析更低的檢測(cè)限，這是因?yàn)楸荛_了常規(guī)樣品前處理過(guò)程中所帶來(lái)的溶劑干擾、以及頂空樣品的某些特殊性的緣故。其由于壓力平衡自動(dòng)進(jìn)樣，重現(xiàn)性更好。由于頂空-氣相色譜儀分析具有獨(dú)特的優(yōu)越性，因此，在食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)、生化科學(xué)分析領(lǐng)域中，得到了廣泛的應(yīng)用。我國(guó)公安部發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T 1073-2013《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗(yàn)方法》[1]和GA/T 842-2019《血液酒精含量的檢驗(yàn)方法》[2]中對(duì)血液中乙醇的測(cè)定就是通過(guò)使用頂空-氣相色譜法，以乙醇的保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定性，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量，從而完成對(duì)液中乙醇的定性定量測(cè)定。

1 血液中乙醇測(cè)定影響因素

1.1 色譜柱分析系統(tǒng)的影響

氣化后的樣品在色譜柱種中被分離，隨載氣進(jìn)入檢測(cè)器。因此。色譜柱是氣相色譜儀的核心部件，合理地選擇色譜柱是建立較佳的色譜分析方法的中心環(huán)節(jié)。

色譜柱一般分為：填充柱和毛細(xì)管柱兩大類型。填充柱通常柱長(zhǎng)1～3 m，內(nèi)徑3～6 mm，一般短柱用玻璃管，長(zhǎng)柱用不銹鋼管。毛細(xì)管柱是用玻璃或熔融石英拉制成毛細(xì)管的色譜柱。柱長(zhǎng)20～50 m，內(nèi)徑0.1～0.5 mm。相對(duì)于填充柱來(lái)說(shuō)，毛細(xì)管柱一般具有更高的分離效能，這是因?yàn)椋?1)毛細(xì)管柱孔徑小，內(nèi)壁固定液膜極薄，中心是空的，故阻力很小，而且渦流擴(kuò)散項(xiàng)不存在，譜帶展寬變小。由于毛細(xì)管柱的阻力很小，其長(zhǎng)度可為填充柱的幾十倍，其總柱效比填充柱高得多。(2)毛細(xì)管柱的分析速度約為填充柱的數(shù)十倍。由于液膜極薄，分配比k很小，相比大，組分在固定相中的傳質(zhì)速度極快，因此有利于提高柱效和分析速度。(3)柱使用壽命長(zhǎng)。當(dāng)然，毛細(xì)管柱也有其局限性。因其內(nèi)徑小，柱容量小，且對(duì)進(jìn)樣技術(shù)的要求更高，所以載氣流速的控制要求更為精確。進(jìn)樣量越小，意味著對(duì)檢測(cè)器的靈敏度要求就更高。因此，在血液中乙醇檢測(cè)的氣相色譜系統(tǒng)中，常用的色譜柱為毛細(xì)管色譜柱，檢測(cè)器為FID檢測(cè)器(火焰離子化檢測(cè)器)。在GA/T 1073-2013《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗(yàn)方法》和GA/T 842-2019《血液酒精含量的檢驗(yàn)方法》氣相色譜檢測(cè)參考條件中，DB-ALC1和DB-ALC2就是血液中乙醇分析中常用的超高惰性色譜柱，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都能保持良好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。

1.1.1 單柱與雙柱的定性

采用頂空-氣相色譜法(單柱單檢測(cè)器)進(jìn)行血液中乙醇含量檢測(cè)時(shí)，當(dāng)存在與乙醇(如鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑)具有相似色譜行為的化合物時(shí)，在某些特定的色譜條件下，此類化合物的保留時(shí)間會(huì)和乙醇的保留時(shí)間相近，進(jìn)而導(dǎo)致色譜峰重合，最終會(huì)對(duì)檢測(cè)的結(jié)果形成干擾，此時(shí)將無(wú)法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確有效的甄別[3]。當(dāng)定性無(wú)法準(zhǔn)確甄別判定時(shí)，就可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的定性，對(duì)當(dāng)事人造成不利影響，進(jìn)而讓辦案機(jī)關(guān)對(duì)鑒定機(jī)構(gòu)的鑒定質(zhì)量產(chǎn)生質(zhì)疑。

通過(guò)改變色譜柱、柱溫、載氣流速等氣相色譜檢測(cè)條件，可在一定程度上排除此類干擾物對(duì)乙醇定性分析的影響。因此，使用區(qū)分效能充足的雙色譜柱和雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)進(jìn)行血液中乙醇含量檢測(cè)是定性判定的關(guān)鍵因素，雙柱雙檢測(cè)器的氣相色譜系統(tǒng)可以顯著降低假陽(yáng)性判定的發(fā)生率，從而最終達(dá)到保障檢測(cè)機(jī)構(gòu)公信力的目的。

1.1.2 雙柱存在定量差異

在日常檢測(cè)工作中，血液中乙醇的定量方法通常采用內(nèi)標(biāo)法(主要為內(nèi)標(biāo)工作曲線法)。即在一系列不同濃度對(duì)照品溶液中加入相同內(nèi)標(biāo)物，分別測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)對(duì)照品溶液濃度作線性回歸，求出線性回歸方程或繪制工作曲線，最終測(cè)定檢材的待測(cè)物的濃度。檢測(cè)過(guò)程中若出現(xiàn)干擾物，尤其是干擾物與內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間相近，此時(shí)便會(huì)造成內(nèi)標(biāo)物與干擾物未良好分離，從而導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積受到影響，最終造成雙柱的定量結(jié)果有較大差異。2016 年，文迪等[4]在對(duì)兩例血液乙醇含量檢測(cè)中，均檢出了丙酮成分，丙酮與叔丁醇的保留時(shí)間重合導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積增加。2019年，許龍慧等[5]在對(duì)一例血液乙醇含量檢測(cè)中，檢出未知干擾物，干擾物與叔丁醇的保留時(shí)間重合導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積增加。當(dāng)內(nèi)標(biāo)峰面積增加，最終會(huì)使乙醇測(cè)定值降低，對(duì)乙醇定量結(jié)果產(chǎn)生干擾。因此，在檢測(cè)過(guò)程中，還應(yīng)該特別注意未知干擾物對(duì)檢測(cè)體系的影響。雙柱雙檢測(cè)器是提高氣相色譜系統(tǒng)抗干擾能力有效方法(其中前文提到的DB-ALC2由于獨(dú)特的極性，對(duì)于關(guān)鍵的乙醇/丙酮峰，比其它血液乙醇確證毛細(xì)管柱有更高的分離度)，通過(guò)雙柱雙檢測(cè)器系統(tǒng)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)邊峰面積的異常變化，除此之外，檢測(cè)機(jī)構(gòu)在日常工作中，需要經(jīng)常關(guān)注容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的有關(guān)化合物和干擾物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有條件的機(jī)構(gòu)還可以通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)未知干擾物進(jìn)行定性的確證分析。

1.2 血液樣本的采集和保存條件的影響

1.2.1 血液采集前處理

在采集血液前的消毒過(guò)程中，如果抽血人員使用了含有乙醇類的消毒劑時(shí)，并且在消毒劑未揮發(fā)前便進(jìn)行采血，可能導(dǎo)致提取的血液受到外來(lái)乙醇污染，并最終引發(fā)血液中乙醇的定量結(jié)果異常升高的問(wèn)題[6]。因此采集血液樣本時(shí)，皮膚消毒劑宜使用不含醇類的聚維酮碘、0.1%苯扎氯銨溶液、0.1%苯扎溴銨溶液、1.0%醋酸氯己定溶液、雙氧水(20%)及不含乙醇的碘伏溶液，不應(yīng)使用含醇類或其他揮發(fā)性有機(jī)物的消毒劑[7]，徹底避免血液的假性升高問(wèn)題。

1.2.2 血液采集部位

真空靜脈采血由于在全封閉的系統(tǒng)下進(jìn)行，而且真空采血管蓋帽密封性較好、膠塞中間有凹槽，這樣從根本上減少了血液受到接觸污染的機(jī)會(huì)，降低了血液樣本污染、溶血、凝血的發(fā)生，因此，活體的血液采集一般都選擇體表淺靜脈的真空采血。但是在有人員傷亡的交通事故或者因酗酒導(dǎo)致乙醇中毒的死亡案件中，由于人體在死亡后，身體代謝機(jī)能停止，胃內(nèi)的乙醇會(huì)彌散到鄰近的器官，當(dāng)彌散發(fā)生后，此時(shí)各器官組織內(nèi)的乙醇含量會(huì)存在明顯的差別。采集不同器官組織部位的血液，最終的乙醇定量結(jié)果也會(huì)不同。因此，在抽取尸體血液時(shí)，為了防止乙醇彌散所帶來(lái)的影響，此時(shí)需要首選股靜脈或鎖骨下靜脈血液采集；溺死尸體因液體進(jìn)入肺內(nèi)，心血被稀釋，亦應(yīng)采周圍血；對(duì)于損傷嚴(yán)重或殘缺的尸體，在無(wú)法提取到股靜脈或鎖骨下靜脈血液時(shí)，則可選擇心臟包腔血液[7]。

1.2.3 血液的保存

(1)血液儲(chǔ)存容器

謝春等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同儲(chǔ)存容器對(duì)血液中乙醇濃度均有影響。普通采血管的乙醇濃度高于真空普通管，而真空普通管的乙醇濃度又高于真空抗凝管。造成乙醇濃度有差異的原因是：真空抗凝管能使血液保持在真空封閉的狀態(tài)，避免了乙醇的揮發(fā)、阻止了抗凝管內(nèi)外物質(zhì)的交換，并且因?yàn)榭鼓齽┑奶砑?，有效防止了血液發(fā)生凝固。使用普通采血管、甚至促凝劑管采集的血樣，由于采血管內(nèi)未添加抗凝劑，血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，血細(xì)胞聚集從而形成血凝塊。當(dāng)血液發(fā)生凝固后，此時(shí)采血管內(nèi)的固相便會(huì)增加、而相對(duì)應(yīng)的液相便會(huì)減少，最終導(dǎo)致血樣中乙醇含量檢測(cè)結(jié)果比抗凝管的結(jié)果高，因此真空抗凝管是血液中乙醇測(cè)定中樣本儲(chǔ)存的最佳容器。而在常見(jiàn)的真空抗凝管中，當(dāng)抗凝劑的種類不同時(shí)，因?yàn)榭鼓茏陨硭囊后w體積會(huì)有差異，所以采集血樣后，不同種類抗凝劑對(duì)血液的稀釋作用也會(huì)有差異，最終導(dǎo)致血樣中乙醇含量定量結(jié)果也會(huì)有差異。涂國(guó)章等[9]研究發(fā)現(xiàn)EDTA-K2采血管作為儲(chǔ)存容器時(shí)，其血液乙醇含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性最好。因此，道路交通執(zhí)法人員為了確保血液乙醇檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好采用EDTA-K2采血管來(lái)儲(chǔ)存涉嫌酒駕的的人員的血樣，并按相關(guān)規(guī)定送檢。

(2)采血管的保存條件

血樣在保存過(guò)程中，會(huì)因溫度和時(shí)間而發(fā)生不同程度的自溶、腐敗、揮發(fā)、氧化等問(wèn)題，不同溫度及時(shí)間對(duì)保存血液的有效期和質(zhì)量均有影響，隨溫度的升高，血液保存時(shí)效將會(huì)縮短，血液質(zhì)量將因損傷加強(qiáng)而下降，同一時(shí)期內(nèi)血液保存損傷作用隨溫度的降低而減輕[10]，所以血液乙醇含量檢測(cè)必須控制好合適的血樣保存溫度以確保血液質(zhì)量在有效的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變化，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。涂國(guó)章等[11]研究的4個(gè)溫度保存條件中，14天內(nèi)保存可在4～8 ℃冰箱冷藏，較長(zhǎng)時(shí)間則在-20 ℃冰柜保存對(duì)血液乙醇含量檢測(cè)影響較小。因此，執(zhí)法機(jī)構(gòu)在按照規(guī)定抽血后需要低溫保存并及時(shí)送檢，檢測(cè)機(jī)構(gòu)在受理委托后，需要及時(shí)鑒定，不能及時(shí)鑒定的也必須低溫直立保存。

1.3 腐敗尸體血

人體死亡后，在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和空氣氣流條件下，組織蛋白質(zhì)會(huì)在人體內(nèi)的微生物(主要是腐敗細(xì)菌)的作用下發(fā)生腐敗分解，從而發(fā)生尸體腐敗。尸體腐敗會(huì)伴隨產(chǎn)生乙醇、正丙醇、正丁醇等多種產(chǎn)物，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腐敗程度會(huì)加重。尤其是超過(guò)一天的尸體，不可忽視死后組織腐敗產(chǎn)生的乙醇量。針對(duì)死后腐敗血液中乙醇含量測(cè)定，需要綜合考慮死者生前的飲酒史以及是否患有糖尿病，避免血液腐敗后的自生醇現(xiàn)象對(duì)乙醇含量測(cè)定結(jié)果分析產(chǎn)生干擾[12]。劉兆等[13]研究發(fā)現(xiàn)腐敗尸體中生成的正丙醇和乙醇具有相關(guān)性，尸體在產(chǎn)生乙醇的同時(shí)，會(huì)平行地產(chǎn)生正丙醇，如果血中乙醇含量在正丙醇的20倍以內(nèi)，可以認(rèn)定是死后產(chǎn)生的乙醇；如超過(guò)此值，則系生前飲酒的標(biāo)志。但是隨著研究的不斷深入，正丙醇已不能作為血液中乙醇系腐敗產(chǎn)生的唯一依據(jù)，其作為腐敗尸體中乙醇生成濃度的指標(biāo)價(jià)值變得越來(lái)越有限。禹明筠等[14]研究表明，尸體血樣腐敗產(chǎn)生的乙醇不能導(dǎo)致 EtG (乙基葡萄糖醛酸苷)或 EtS (乙基硫酸酯)的產(chǎn)生。因此，血樣中的 EtG 和 EtS 可作為判斷尸體血樣中乙醇生前入體和死后產(chǎn)生的依據(jù)，從而避免由于較高濃度的自生乙醇而導(dǎo)致乙醇認(rèn)定的假陽(yáng)性結(jié)果。除此之外，腐敗尸體也可取玻璃體液測(cè)定乙醇含量(玻璃體液的乙醇含量在尸體腐敗后一段時(shí)間內(nèi)仍能保持穩(wěn)定，血液與玻璃體液乙醇濃度的比例系數(shù)是0.98)。

1.4 檢測(cè)機(jī)構(gòu)日常質(zhì)量控制

在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中，日常的質(zhì)量控制是檢測(cè)機(jī)構(gòu)最基本同時(shí)也是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。一、檢測(cè)人員除了要具備最基本的相關(guān)專業(yè)知識(shí)和檢測(cè)能力以外，還得不斷學(xué)習(xí)新的專業(yè)技能，做到與時(shí)俱進(jìn)，并且按時(shí)進(jìn)行考核。二、檢測(cè)機(jī)構(gòu)按照規(guī)范要求配備好相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備后，在進(jìn)行檢測(cè)工作前，必須要對(duì)相應(yīng)的設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)檢定，保證設(shè)備能夠達(dá)到相對(duì)應(yīng)的校準(zhǔn)檢定的規(guī)范要求達(dá)到的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，并制定期間核查計(jì)劃和設(shè)備維護(hù)計(jì)劃。三、檢測(cè)機(jī)構(gòu)需要定期查新血液中乙醇測(cè)定的檢驗(yàn)規(guī)范和要求，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)或者能力驗(yàn)證考核，優(yōu)化好設(shè)備的儀器參數(shù)條件。四、制備曲線時(shí)候所用到的標(biāo)準(zhǔn)品(不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)樣品)一定得選擇有質(zhì)檢證書的國(guó)家級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且標(biāo)準(zhǔn)品在有效期內(nèi)，這樣才能保證曲線的有效性及準(zhǔn)確性。五、檢驗(yàn)檢測(cè)的環(huán)境條件需要滿足相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)環(huán)境條件的記錄需要真實(shí)和及時(shí)。檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到檢測(cè)人員、分析儀器、檢測(cè)方法和技術(shù)、檢材質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等影響而產(chǎn)生一定的誤差，產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果的不確定度。血液中乙醇含量檢測(cè)的不確定度主要來(lái)于檢材重復(fù)性檢測(cè)、乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線和氣相色譜儀的誤差[15]。因此檢測(cè)機(jī)構(gòu)的日常質(zhì)量控制，是一項(xiàng)系統(tǒng)、復(fù)雜但是又基本、關(guān)鍵的工作，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)該重視日常的質(zhì)量控制管理工作。

2 結(jié) 論

在司法鑒定中，血液中乙醇濃度測(cè)定的鑒定意見(jiàn)被視為醉駕案件審判的重要證據(jù)之一，其鑒定意見(jiàn)的合法性、真實(shí)性、準(zhǔn)確性將會(huì)直接影響辦案機(jī)關(guān)審判的公平公正，同時(shí)在酒駕醉駕案件處理、處罰及量刑上起著決定性作用。因此，檢測(cè)機(jī)構(gòu)在日常的血液中乙醇檢測(cè)工作中，通過(guò)識(shí)別并規(guī)避血液中乙醇測(cè)定中的不利影響因素，可有效提高血液中乙醇測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高其司法鑒定意見(jiàn)的證據(jù)價(jià)值。