不同鹵水添加量對(duì)豆腐凝膠特性的影響

力雯慧，張志衡，楊雅婧，李玉娥，陳振家*

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（晉中 030801）

大豆起源于中國(guó)，距今已有數(shù)千年的歷史，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，主要成分有蛋白質(zhì)（40%）、碳水化合物（35%）和油脂（20%）。豆腐是中國(guó)傳統(tǒng)的豆制品，其營(yíng)養(yǎng)豐富、熱量較低，深受大眾喜愛。豆腐主要是大豆經(jīng)過浸泡、磨漿、煮漿、點(diǎn)漿、蹲腦和壓制成型等工藝制成的[1]，其中點(diǎn)漿是最關(guān)鍵的一步。凝固劑的選擇對(duì)豆腐的感官性質(zhì)有著重要影響。劉寧等[2]將凝固劑分為7種，即鹽類凝固劑、酸類凝固劑、酶類凝固劑、豆清發(fā)酵液、復(fù)合凝固劑、多糖類凝固劑和生物凝固劑。試驗(yàn)用到的是鹽類凝固劑，市場(chǎng)上常見的鹽類凝固劑主要分為鎂鹽和鈣鹽2種，常用的有鹵水（主要成分為MgCl2）和石膏（主要成分為Ca2SO4），使用鹽凝固劑做出來的豆腐風(fēng)味鮮美，出品率高但存放期短。

鹵水豆腐是我國(guó)最常見的豆腐，使用的凝固劑一般稱之為鹵水，其主要成分為氯化鎂。鹵水豆腐具有較大的彈性及較強(qiáng)的硬度和韌性，質(zhì)地不如內(nèi)酯豆腐質(zhì)地軟嫩，水分相對(duì)較低，在80%左右，但彈性較好，而正是由于水分少，故而鹵豆腐特有的風(fēng)味更加濃，質(zhì)地更硬且更適宜烹飪。但現(xiàn)階段對(duì)于鹵水豆腐品質(zhì)特性的研究不夠深入，關(guān)于鹵水豆腐凝固機(jī)理存在很大爭(zhēng)議，這些問題需要進(jìn)一步探究。試驗(yàn)主要研究鹵水豆腐凝膠特性和凝固過程隨鹵水（MgCl2）添加量的變化規(guī)律，為鹵水豆腐的凝固機(jī)理提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與儀器

1.1 原料與試劑

大豆（綏化市正大米業(yè)有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250、β-巰基乙醇、牛血清蛋白、SDS、溴酚藍(lán)、過硫酸銨、低分子量蛋白標(biāo)樣、三羥甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺（北京索萊寶科技有限公司，分析純）；甲叉雙丙烯酰胺、無水乙醇、甘氨酸、甘油（生工生物工程股份有限公司，分析純）；氯化鈉、尿素、羅丹明（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；氫氧化鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，分析純）；硫酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司，分析純）；氯化鎂（安琪酵母股份有限公司，食品級(jí)）；硫酸鉀（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純）；硫酸銅（天津市北辰方正試劑廠，分析純）。

1.2 主要設(shè)備與儀器

FSM-120-4P型分離式磨漿機(jī)（沈陽市食品機(jī)械制造有限公司）；XS-C型成型機(jī)（天思食品機(jī)械有限公司）；TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀（Food Technology Corporation）；DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；UV-1200型可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限儀器公司）；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋、79-1型磁力加熱攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）；HC-2064型高速離心機(jī)、KDC-1044L型大容量低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃均質(zhì)機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker德國(guó)布魯克）；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡（Leia）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆乳的制備

參考Guo等[3]的方法并做一定修改。將大豆用清水清洗3次，在室溫下浸泡12 h，待水分瀝干后，將大豆與水以1∶5（g/mL）比例混合磨漿，粗漿經(jīng)0.075 mm孔徑（200目）過篩去除豆渣后，加熱煮沸5 min，保溫備用。

1.3.2 鹵水豆腐的制備

將黃豆清洗3次，去除雜質(zhì)和灰塵，在室溫下浸泡約12 h。待水分瀝干后，將黃豆與水以1∶5（g/mL）比例混合，利用分離式磨漿機(jī)磨漿，加熱煮沸5 min。配制15%鹵水（MgCl2溶液）作為凝固劑，在豆?jié){溫度下降到85 ℃時(shí)，加入鹵水進(jìn)行凝固，鹵水添加量分別為2.0%，3.5%和5.0%（V/V），85 ℃下保溫10 min，使用成型機(jī)壓制成型。

1.3.3 鹵水豆腐質(zhì)構(gòu)性的測(cè)定

將制備好的鹵水豆腐切成4 cm×4 cm×1 cm立方體，采用質(zhì)地多面剖析法（TPA）測(cè)定豆腐質(zhì)構(gòu)特性[4]。測(cè)試參數(shù)：測(cè)試速度60 mm/s，測(cè)試后速度200 mm/s，探頭回升高度15 mm，擠壓距離5 mm，測(cè)試間隔3 s，起始力0.4 N；每個(gè)樣品需重復(fù)測(cè)定10次。

1.3.4 鹵水豆腐得率、含水量及保水性的測(cè)定

按照Kang等[5]的方法測(cè)定豆腐得率，將制作好的豆腐于室溫下靜置5 min后稱重，計(jì)算100 g干大豆所得豆腐的質(zhì)量，即為豆腐得率，按式（1）計(jì)算。

式中：W1為豆腐質(zhì)量，g；W2為干大豆質(zhì)量，g。

參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥[6]測(cè)定豆腐的含水量（MC）。

根據(jù)王睿粲[7]的方法測(cè)定豆腐保水性。選用帶有內(nèi)管的50 mL離心管，內(nèi)管底部為網(wǎng)狀，放入濾紙片后，稱取濾紙片和內(nèi)管的質(zhì)量m1，將約1 g豆腐放在濾紙上，稱內(nèi)管和豆腐的總質(zhì)量m2，以4 000 r/min離心10 min后，再次稱內(nèi)管和豆腐的質(zhì)量m3，豆腐的保水性按照式（2）測(cè)得。

1.3.5 鹵水豆腐中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[8]。

1.3.6 鹵水豆腐凝膠作用力的測(cè)定

參考Gómez-Guillén等[9]方法。用小刀切取3 g豆腐凝膠放入研磨器內(nèi)，分別與20 mL的0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.2 mol/L β-ME（SE）破碎均質(zhì)，定容后以10 000×g離心10 min。利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。溶解于SB溶液與SA溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示離子鍵的貢獻(xiàn)，溶解于SD溶液與SC溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示疏水性相互作用的貢獻(xiàn)，溶解于SC溶液與SB溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示氫鍵的貢獻(xiàn)，溶解于SE溶液與SD溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示二硫鍵的貢獻(xiàn)。

1.3.7 SDS-PAGE

樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5 mg鹵水豆腐加入樣品處理液中，加蒸餾水使總體積為1 mL，振蕩均勻冷藏后可進(jìn)行使用。若樣品為液體，則需根據(jù)蛋白濃度確定，使最終溶液中蛋白濃度為1 mg/mL。

SDS-PAGE電泳采用Lars等[10]的方法，制得的分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，上樣量6 μL，恒壓電泳，電流40 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳完畢，固定2 h，染色3 h，脫色2 h，結(jié)束后拍照成像，并分析圖譜。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參照Shin等[11]的方法。將制備好的生豆?jié){、熟豆?jié){及豆腐在真空冷凍干燥作用下凍干成粉狀。將凍干樣品和KBr以1∶100（W/W）比例在研缽內(nèi)研磨均勻，使用壓片機(jī)將混合物壓成明片狀（壓力10 MPa、時(shí)間1 min），準(zhǔn)備完成后即可進(jìn)行測(cè)定。所選用的波長(zhǎng)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)24次。利用Peakfit軟件對(duì)測(cè)定圖譜進(jìn)行基線校正、去卷積和高斯擬合處理，根據(jù)峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用各子峰面積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.9 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)上述的方法制備豆乳，微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定參考Kuipers等[12]方法并稍作改動(dòng)。取100 mL豆乳加入1 mL 0.2%羅丹明溶液，攪拌均勻，分別配制鹵水添加量0，2.0%，3.5%和5.0%的混合溶液，迅速振蕩均勻取10 μL滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，周圍滴加少量指甲油防止水分蒸發(fā)，用錫紙包裹，在90 ℃保溫箱中保溫1 h，冷卻至室溫，測(cè)試前樣品置于陰暗處。使用TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡對(duì)凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)是543 nm，檢測(cè)范圍580～700 nm。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.0和Excel軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS軟件分析不同處理間差異性，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵水添加量對(duì)豆腐質(zhì)構(gòu)性的影響

豆腐的質(zhì)構(gòu)特性是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要方式之一。選擇硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性4個(gè)參數(shù)進(jìn)行分析。有研究指出[13]，豆腐的質(zhì)構(gòu)特性是蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特性的外在表征，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的強(qiáng)弱取決于參與蛋白數(shù)量和凝膠形成方式。

由表1可知，隨著鹵水添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性顯著增加，內(nèi)聚性先降低后升高，彈性先升高后降低，表明鹵水添加量改變了豆腐的質(zhì)構(gòu)特性，隨著鎂離子含量增加，蛋白質(zhì)聚集程度增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成更為完善，凝膠硬度增加。這可能是導(dǎo)致豆腐質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生變化的原因。

表1 鹵水添加量對(duì)豆腐質(zhì)構(gòu)性的影響

2.2 鹵水豆腐得率、含水量及保水性的測(cè)定

豆腐水分狀態(tài)一般用含水量、得率和保水性表示。豆腐含水量是指制得的鮮豆腐中的水分比例；豆腐得率是指一定質(zhì)量的干大豆能夠制得的豆腐質(zhì)量，它主要反映豆?jié){中的蛋白向豆腐凝膠轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化率的高低[14]；凝膠保水性是指蛋白質(zhì)凝膠保留水分的能力，它不僅決定凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)膩程度，還與相關(guān)食品的品質(zhì)有關(guān)[15]。

由圖1可知，2.0%鹵水添加量制備的豆腐含水量、保水性和得率均達(dá)到最高，分別為77.96%，46.85%和166.74%，并隨著鹵水添加量的增加均逐漸降低，可以看出較低的鹵水添加量有利于制備含水量高的嫩豆腐。

圖1 鹵水添加量對(duì)豆腐含水量、保水性及得率的影響

2.3 鹵水豆腐中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

由圖2可知，在鹵水豆腐制備過程中，隨著鹵水添加量的增加，豆腐的總蛋白含量逐漸增加，豆腐中可溶性蛋白含量很少（約0.2%），且隨鹵水添加量的增加未發(fā)生明顯變化，說明鹵水豆腐中的蛋白質(zhì)基本都參與豆腐凝膠結(jié)構(gòu)的形成，只有極少量的可溶性蛋白包裹在凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)部。

圖2 鹵水添加量對(duì)豆腐中蛋白含量和可溶蛋白含量的影響

由圖3可知，通過對(duì)鹵水豆腐中蛋白質(zhì)亞基組成的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著鹵水添加量的增加，豆腐中亞基條帶逐漸加深，可溶性蛋白中幾乎沒有出現(xiàn)亞基條帶，不溶性蛋白的亞基組成與豆腐中的亞基組成基本一致，進(jìn)一步證明鹵水豆腐中的蛋白質(zhì)主要為不可溶蛋白；加入還原劑后，一些大分子聚集體分解，亞基條帶增多，說明二硫鍵參與鹵水豆腐蛋白質(zhì)凝膠的形成。

圖3 鹵水添加量對(duì)豆腐中蛋白質(zhì)亞基組成的影響

2.4 鹵水豆腐凝膠作用力

豆腐在形成凝膠的過程中，通過分子間作用力的變化，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不同。形成蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要是通過疏水作用、氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵和二硫鍵等共價(jià)鍵，在這些作用力的影響下，凝膠達(dá)到平衡狀態(tài)[16]；向豆腐中加入不同含量的鹵水，豆腐凝膠中的作用力也會(huì)發(fā)生變化。

由圖4可知：鹵水豆腐中的分子間作用力包含疏水作用、二硫鍵、離子鍵和氫鍵，其中疏水作用占比最高，也最為重要，鹵水豆腐中作用力貢獻(xiàn)大小排序?yàn)槭杷饔茫練滏I＞二硫鍵＞離子鍵。隨著鹵水添加量的增加，疏水作用增加，二硫鍵大幅下降，氫鍵和離子鍵先增加后減少。由于作用力的結(jié)果是根據(jù)豆腐凝膠在不同溶液中的溶解度差異計(jì)算的，因此不能反映不同豆腐中作用力含量的絕對(duì)值，只能反映各作用力在豆腐中所占比例。總的來說，改變鹵水添加量后豆腐中作用力組成變化明顯，結(jié)合豆腐中蛋白含量的測(cè)定結(jié)果可知，增加鹵水添加量后，豆?jié){中的部分蛋白通過疏水作用結(jié)合到凝膠網(wǎng)絡(luò)中，從而改變了豆腐中作用力的比例。

圖4 鹵水添加量對(duì)豆腐中作用力組成的影響

2.5 SDS-PAGE電泳

由圖5（A）可知：鹵水豆腐在SA、SB、SC、SD這4種溶液中的亞基條帶逐漸增加，說明離子鍵、氫鍵和疏水作用參與鹵水豆腐的形成，在SA、SB、SC溶液中蛋白主要是以分子量較小的11S亞基形式存在；而SD溶液中亞基組成大幅增加且7S亞基占據(jù)主導(dǎo)地位，說明鹵水豆腐中7S亞基間的連接主要依靠的是疏水作用，離子鍵和氫鍵在豆腐形成中的貢獻(xiàn)較低且主要作用于11S的A、B亞基；對(duì)比圖5（A和B）可知，加入還原劑后，豆腐的蛋白亞基組成發(fā)生變化，主要表現(xiàn)在A3亞基的出現(xiàn)、B亞基顏色的加深以及大聚集體（分子量大于100 kDa）的消失，這些亞基主要是在二硫鍵的作用下參與鹵水豆腐的形成。隨著鹵水添加量的增加，亞基條帶顏色加深，表明增加鹵水添加量，分子間作用力增強(qiáng)，更多的蛋白亞基參與到豆腐的形成。

圖5 不同作用力下鹵水豆腐蛋白亞基組成

電泳的結(jié)果與鹵水豆腐分子間作用力的測(cè)定結(jié)果符合，疏水作用和二硫鍵是鹵水豆腐中的主要作用力，疏水作用主要參與7S蛋白的形成，11S蛋白的形成主要與離子鍵、氫鍵和二硫鍵有關(guān)。

2.6 鹵水豆腐紅外測(cè)定

豆腐在形成過程中，其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有密切的關(guān)聯(lián)性[17-18]。紅外光譜圖上不同波峰對(duì)應(yīng)不同的基團(tuán)，如3 250～3 400 cm-1歸屬于羥基基團(tuán)，脂肪族氨基酸殘基分別在2 800～3 000 cm-1和1 440～1 465 cm-1附近歸屬于C—H拉伸和彎曲模式，酰胺Ⅰ帶是研究二級(jí)結(jié)構(gòu)最有用的帶，被指定為C＝O拉伸振動(dòng)，由1 600～1 700 cm-1范圍內(nèi)的波段組成，1 600～1 640，1 640～1 650，1 650～1 660和1 660～1 700 cm-1分別屬于β折疊、無規(guī)則卷曲、α螺旋、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[19]。通過對(duì)不同豆腐中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，能夠反映出凝固劑添加量對(duì)豆腐中蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的影響。

由圖6可知，隨著鹵水添加量的增加，3 250～3 400 cm-1處羥基基團(tuán)吸收峰強(qiáng)度降低，氫鍵作用減弱。由表2可知，生豆?jié){中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要是以β折疊（32.47%）和β轉(zhuǎn)角（34.33%）為主，α螺旋和無規(guī)則卷曲含量相近，分別為16.66%和16.54%。與生豆?jié){相比，熟豆?jié){中除β折疊含量增加外，其他3種結(jié)構(gòu)都有不同程度的減少，這主要是由于加熱使得豆?jié){中蛋白質(zhì)變性，空間結(jié)構(gòu)展開，在氫鍵、疏水作用等化學(xué)鍵的作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的趨勢(shì)增大，即大豆蛋白的熱聚集行為[20]。與豆?jié){相比，鹵水豆腐中β折疊和β轉(zhuǎn)角含量大幅降低，α螺旋含量大幅增加，無規(guī)則卷曲含量小幅增加。鹵水添加量對(duì)豆腐中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響顯著，β折疊的含量隨著鹵水添加量的增加而增加，從12.27%增加到13.61%。β轉(zhuǎn)角含量先降低后升高，從14.23%下降到13.2%，后升高至13.99%。α螺旋含量顯著降低，從53.1%下降至44.82%。無規(guī)則卷曲含量顯著增加，從20.41%上升到27.59%。鹵水豆腐蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序性整體提高，不同鹵水添加量下豆腐中二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異性是其表現(xiàn)出不同凝膠特性的重要原因。

圖6 不同鹵水添加量制備的豆腐中蛋白質(zhì)紅外光譜分析

表2 鹵水豆腐中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比圖 單位：%

2.7 不同鹵水添加量下豆乳凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變化分析

利用激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)可以更直觀地觀察豆乳凝膠的絮凝狀態(tài)。圖7中的簇狀堆積部分是蛋白質(zhì)聚集體經(jīng)過羅丹明標(biāo)記后形成的區(qū)域，而圖中的空隙部分代表水分的分布區(qū)域。結(jié)果表明，不添加鹵水時(shí)，熟豆乳體系中的蛋白質(zhì)粒子分布均勻、致密緊實(shí)，說明蛋白質(zhì)沒有發(fā)生大量聚集，而添加2%的鹵水后，豆乳體系中的蛋白質(zhì)分開始聚集，逐漸形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但此時(shí)的凝膠結(jié)構(gòu)較為連續(xù)，凝膠鏈狀結(jié)構(gòu)形成不充分，且蛋白聚集體間的空隙較小。隨著鹵水添加量的增加，豆乳體系中蛋白質(zhì)的聚集程度進(jìn)一步增加，聚集體間的孔隙明顯變大且分布均勻，表明鹵水添加量的增加極大地增大了蛋白質(zhì)的聚集程度，凝膠結(jié)構(gòu)變得更加有序，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成更為充分。

圖7 不同鹵水添加量形成凝膠的的CLSM圖

3 結(jié)論

通過比較不同鹵水添加量制備的鹵水豆腐的凝膠特性發(fā)現(xiàn)，隨著鹵水添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性增加，質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生顯著性變化。豆腐的含水量、保水性和得率隨著鹵水添加量的增加而逐漸降低，且可溶性蛋白含量逐漸降低，疏水作用增加，二硫鍵占比明顯下降，疏水作用主要參與7S蛋白的形成，離子鍵、氫鍵和二硫鍵主要作用于11S蛋白。在加熱的作用下，豆?jié){中的β折疊含量增加，蛋白質(zhì)發(fā)生大的聚集，而隨著鹵水添加量的增加，β折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，β轉(zhuǎn)角含量先降低后升高，α螺旋含量明顯下降，鹵水添加量對(duì)豆腐中二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。