桔青霉引起透明絲孢霉病1例及文獻總結(jié)

石海燕 陳美 張麗 孫毅 曾同祥 柳兵 張秋秋

(1.長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科，荊州 434100; 2.長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨關(guān)節(jié)科，荊州 434100)

青霉菌屬(Penicillium)在我們的生活環(huán)境中雖無處不在，但極少引起人類疾病[1]。我科發(fā)現(xiàn)1例以單發(fā)皮膚斑塊、結(jié)節(jié)，少許破潰、結(jié)痂為表現(xiàn)的患者。經(jīng)熒光鏡檢、組織病理、活檢組織培養(yǎng)菌落菌種及來自蠟塊組織的分子鑒定，最終確診為桔青霉引起的透明絲孢霉病，匯報如下。

1 臨床資料

1.1 臨床病史

患者，女，55歲，因左手前臂處斑塊結(jié)節(jié)4個月余來我院門診就診。4個月余前患者無明顯誘因左手前臂處出現(xiàn)綠豆大小暗紅色斑塊，后逐漸增大，出現(xiàn)破潰、結(jié)痂。在此期間曾至多家醫(yī)院就診，按“濕疹”治療，未見明顯療效。偶伴瘙癢、疼痛不適。既往無特殊病史，未飼養(yǎng)寵物。體檢檢查：生命體征平穩(wěn)，系統(tǒng)查體未見特殊。皮膚科專科檢查：左手前臂處可見大小約1 cm×3 cm暗紅色斑塊、結(jié)節(jié)，少許破潰、結(jié)痂(見圖1A)。真菌鏡檢：取皮膚表面組織直接顯微鏡下熒光染色，可見少許熒光染色陽性的菌絲(見圖2A)；手術(shù)取活檢組織，同時病理檢查、細菌培養(yǎng)及真菌培養(yǎng)。

1.2 組織病理

鏡下見被覆鱗狀上皮增生，上皮腳延長，真皮內(nèi)及血管周圍大量中性粒細胞浸潤、淋巴細胞及組織細胞，少許嗜酸性粒細胞，個別多核巨細胞吞噬異物，10倍鏡下HE染色可見清晰的菌絲樣成分；4倍鏡及10倍鏡下的PAS染色可見大量真菌菌絲，偶見分枝狀(見圖3)。

1.3 菌種鑒定

源自活檢組織培養(yǎng)后的真菌DNA提取及測序 取活檢組織接種于沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，含卡那霉素100 μg/mL)中，放置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，挑取長出的菌落接種至SDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，進行形態(tài)學(xué)觀察：觀察菌落形態(tài)，考慮青霉屬真菌(見圖2B)；同時利用Omega D3390-02 Fungal DNA Kit真菌DNA小量提取試劑盒(北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)提取DNA，利用引物ITS1和ITS4對其真菌DNA的ITS區(qū)進行擴增，擴增體系如下：反應(yīng)體系50 μL，模板DNA 11 μL，上下游引物各2 μL，2×Hieff?PCR Master MIX 25 μL,添加滅菌注射用水補足至50 μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min 30 s,94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 共30個循環(huán)，后72℃延伸10 min。將擴增的PCR產(chǎn)物送至上海生工武漢分公司測序，測序結(jié)果登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)進行Blast比對，結(jié)果與桔青霉(P.citrinumstrain SCSAAF0015)的DNA序列一致度為99%(見圖4)。

源自福爾馬林固定后石蠟包埋的組織(FFPE)DNA提取鑒定 將蠟塊標本連續(xù)切片處理后，置于1.5 mL的無菌EP管中；采用QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen；Hilden，德國)提取總DNA。選用真菌通用引物12F和13R對上述所提取DNA進行擴增[2]，擴增體系如下：反應(yīng)體系為25 μL，模板DNA 100 ng，上下游引物各1 μL，金牌MIX補足至25 μL；反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性4 min,98℃變性1 min，退火52℃ 1 min，延伸72℃ 1 min 共40個循環(huán)，后延伸72℃ 2 min。將擴增的PCR產(chǎn)物送至天一輝遠有限公司測序。測序所得結(jié)果確為桔青霉(P.citrinum)(見圖5)，與病變組織培養(yǎng)出來的真菌測序比對結(jié)果一致。

1.4 藥物敏感性試驗

參考美國臨床實驗室標準研究所(CLSI)M38-A2方案[3]，配制RPMI 1 640液體培養(yǎng)基，過濾滅菌后備用。近平滑念珠菌(ATCC22019)作為本試驗的質(zhì)控菌株。將受試桔青霉接種至SDA培養(yǎng)基上，放置35℃溫箱培養(yǎng)3 d后收集孢子重懸于用生理鹽水中，再用血細胞計數(shù)板調(diào)整孢子量為(2～4)×106CFU/mL；然后用RPMI 1 640液體培養(yǎng)基將調(diào)整好的菌懸液稀釋100倍使其終濃度為(2～4)×104CFU/mL。將所用的實驗藥物伊曲康唑倍比稀釋成2倍于終濃度后加入96孔板中，藥物濃度范圍為0.03～4 μg/mL，每孔加入100 μL，再加入100 μL稀釋后的菌懸液。H1孔為生長對照(無藥物孔)和H10孔為空白對照(無菌孔)。放置35℃溫箱孵育48 h。然后肉眼觀察判讀結(jié)果，最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)讀取肉眼觀察到的真菌生長100%受抑制的最低藥物濃度。

1.5 診斷與治療

診斷 桔青霉所致的透明絲胞霉病。經(jīng)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)鑒定，分離菌種鑒定為桔青霉。

治療 微量液基稀釋法測得伊曲康唑?qū)Υ私矍嗝沟腗IC值為0.5 μg/mL。根據(jù)臨床經(jīng)驗及實驗結(jié)果抗真菌治療予伊曲康唑200 mg/d口服治療。治療1個月后復(fù)診，皮疹較前明顯好轉(zhuǎn)，皮疹范圍明顯縮小，斑塊結(jié)節(jié)變小，破潰糜爛面愈合(見圖1B)。

2 討 論

桔青霉(P.citrinum)極少引起人類感染，屬于一種條件致病菌[4]，可引起角膜炎、皮膚感染、肺炎。在我們的病例中，患者皮損處的皮屑直接熒光鏡檢陽性，手術(shù)取得活檢組織切除后進行組織病理檢查提示真菌感染，與此同時發(fā)現(xiàn)活檢組織培養(yǎng)陽性，我們提取了來自活檢組織培養(yǎng)后的真菌DNA，并對其DNA進行擴增并送測序，測序結(jié)果提示桔青霉，為進一步明確菌種，我們又對蠟塊組織的真菌DNA進行了分子生物學(xué)鑒定(由北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科宋營改博士輔助完成)，比對了來自活檢組織培養(yǎng)出來的真菌DNA和來自蠟塊組織的真菌DNA序列，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果均為桔青霉，最終確診為桔青霉所致的透明絲胞霉病，可排除實驗室污染的可能。我們檢索到6例人類桔青霉感染的報道，均發(fā)生在免疫受損的患者，其中4例引起嚴重的肺部疾病[5-7]，1例在白內(nèi)障術(shù)后導(dǎo)致眼內(nèi)炎[8]，另1例在急性白血病患兒導(dǎo)致皮膚的感染[9]。均通過微生物學(xué)及組織病理學(xué)確診。其中3例均發(fā)生在接受強化化療的白血病患者中，肺部感染患者在接受甲強龍抗炎治療的同時給予抗真菌藥物(兩性霉素B、卡泊芬凈、氟康唑、泊沙康唑或伊曲康唑)治療。導(dǎo)致眼內(nèi)炎的患者玻璃體腔內(nèi)注射兩性霉素B，口服氟康唑，但最終療效欠佳摘除眼球；而在我們的病例中，患者自述既往無特殊病史，門診檢查血糖值正常，且未發(fā)現(xiàn)患者有其他免疫系統(tǒng)受損疾病，因此筆者推測可能由外傷引起的真菌感染。雖然針對桔青霉引起的透明絲孢霉病目前國際上沒有標準的診療指南，但是根據(jù)美國德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心(University of Texas Health Science Center at Houston)的真菌檢測實驗室對10株桔青霉抗真菌藥物敏感性試驗報告，兩性霉素B MIC≤1 μg/mL，卡泊芬凈MIC≤0.125 μg/mL，米卡芬凈MIC≤0.25 μg/mL，伊曲康唑MIC≤4 μg/mL，泊沙康唑為MIC≤2 μg/mL，伏立康唑MIC>16 μg/mL[10]，伏立康唑的最低抑制濃度很高(MIC>16 μg/mL)，而其他三唑類和其他類型的抗真菌劑的MIC均小于或等于4 μg/mL，因此伏立康唑不能作為桔青霉感染抗真菌治療的一線用藥。另外有研究證實兩性霉素B和伊曲康唑常用于治療青霉菌感染引起的真菌病，但因兩性霉素B不良反應(yīng)較大、成本較高等弊端，大多情況下我們用廣譜抗真菌藥伊曲康唑代替兩性霉素B治療[11]。因此我們在對其進行分子鑒定的同時根據(jù)病理及傳統(tǒng)的真菌學(xué)檢查結(jié)果給予伊曲康唑200 mg/d口服治療1個月后，患者病情取得良好的改善。

致 謝

感謝北京大學(xué)第一醫(yī)院李若瑜教授對本例患者診治過程中給予的幫助和指導(dǎo)。