煙曲霉唑類藥物耐藥檢測方法研究進展

李姝麗 吳秀禎 王志賢 盛長忠 周澤奇 陳龍

[1.天津大學醫(yī)學工程與轉化醫(yī)學研究院，天津 300072; 2.天津市侵襲性真菌病精準診斷技術企業(yè)重點實驗室，天津 300467; 3.丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津 300467; 4.天津科技大學輕工技術與工程學院，天津 300457]

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是導致曲霉病的最常見病原體，唑類藥物如伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑是治療曲霉病的一線藥物。近年來，隨著唑類藥物的廣泛使用，全球范圍內的煙曲霉耐藥率迅速增加，嚴重威脅患者的生命安全[1]。煙曲霉唑類耐藥機制有多種，其中最常見的是cyp51A基因突變導致蛋白質構象的變化[2-3]。常見的耐藥檢測方法主要包括基于分離培養(yǎng)的耐藥檢測、質譜、NGS技術和PCR技術。煙曲霉耐藥機制的研究及耐藥菌的鑒定對指導臨床用藥具有重要意義。文章對臨床或文獻報道的煙曲霉唑類耐藥機制及檢測方法進行總結。

1 煙曲霉唑類藥物耐藥機制

唑類藥物包括氟康唑、酮康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等，是治療曲霉病的一線藥物。唑類藥物通過非競爭性地抑制細胞膜中麥角固醇合成通路中的關鍵蛋白-羊毛甾醇14-α-去甲基化酶(Cyp51A)的活性，影響麥角固醇的生物合成，進而影響細胞膜的流動性和膜結合蛋白酶的活性，從而殺傷菌體[4]。

已報道的煙曲霉唑類耐藥機制包括：Cyp51A蛋白構象改變或過表達、外排泵相關蛋白過表達、細胞應激反應和形成生物被膜等，其中由cyp51A基因突變引起的蛋白構象改變是最重要的耐藥機制[5]。超過20種cyp51A點突變，如G54、G138、M220、G448等，可引起蛋白構象改變，致使唑類藥物不能與之結合而產(chǎn)生耐藥性[6-7]。另外，cyp51A基因的啟動子區(qū)串聯(lián)重復序列(tandem repeat，TR)，如TR34/L98H和TR46/Y121F/T289A可以使Cyp51A蛋白過量表達，從而增加菌體對唑類藥物的耐受性，這種情況約占全部唑類耐藥突變類型的80%[8]。

2 耐藥檢測方法

2.1 基于分離培養(yǎng)的耐藥檢測方法

分離培養(yǎng)是耐藥檢測的“金標準”，典型方法是標準肉湯稀釋法和瓊脂/紙片擴散法。美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)和歐洲藥敏試驗聯(lián)合委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)分別針對絲狀真菌制定了標準化的藥敏實驗方法及判讀標準[9]。

肉湯稀釋法 肉湯稀釋法是測定抗真菌藥物最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的標準方法。實驗時，在微孔板中加入等量的真菌培養(yǎng)基和連續(xù)稀釋的抗真菌藥物，孵育一段時間后，通過觀察培養(yǎng)基的渾濁度判斷真菌的生長情況。目前，商業(yè)化產(chǎn)品有英國的Sensititre YeastOne?(TREK Diagnostic Systems, West Sussex, UK)顯色藥敏板，適用于念珠菌、曲霉和隱球菌等。它在每個稀釋孔中加入了顯色試劑，可根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化判斷真菌的生長或抑制，其中紅色表示生長、紫色表示生長抑制、藍色表示無生長[10]。該方法可用于兩性霉素B、氟胞嘧啶、多種棘白菌素類藥物和伏立康唑、泊沙康唑等三唑類藥物的抗真菌活性的測定[11]。

瓊脂/紙片擴散法 基于瓊脂/紙片擴散法的商業(yè)化產(chǎn)品中，最常用的是法國生物梅里埃公司的E-test?(Biomérieux, Marcy-l’étoile, France)[12]。該方法是在試紙條上包被一定濃度梯度的抗真菌藥物，將其置于涂有煙曲霉孢子懸浮液的平板中，孵育24～48 h后，會在平板上觀察到橢圓形的生長抑制。該方法能夠測定兩性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬凈、伏立康唑、泊沙康唑等多種抗真菌藥物對煙曲霉的MIC值[13]，在煙曲霉的耐藥檢測中廣泛使用，常用于對肉湯稀釋法藥敏檢測結果的復驗。

基于分離培養(yǎng)的耐藥檢測方法得到的結果比較可靠、檢測成本低，臨床上廣泛應用。但由于檢測周期長、敏感性低、培養(yǎng)過程易污染，難以滿足臨床早期快速診斷的需求。

2.2 質譜檢測方法

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionizationationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是目前發(fā)展最快的耐藥檢測技術之一。該方法使用復合相關指數(shù)(composite correlation index，CCI)分析不同濃度藥物壓力下細胞產(chǎn)生的蛋白譜之間的相關性，得到最低藥物濃度(minimal profile change concentration，MPCC)，近似于肉湯稀釋法的MIC值[14]。該方法可準確檢測出耐伏立康唑的煙曲霉菌株，并在檢測煙曲霉對卡泊芬凈的耐藥性方面與肉湯稀釋法有很好的一致性[15]。相較于真菌藥敏實驗，MALDI-TOF MS檢測速度快、所需的樣本量少、檢測通量大、覆蓋菌種范圍廣，非常適合臨床實驗室檢測。但是MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)分析依賴于強大的數(shù)據(jù)庫資源，隨著對真菌種類和耐藥突變研究的不斷深入，需對數(shù)據(jù)庫進行持續(xù)更新。另外，不同地域的真菌病原種類及藥物耐受情況不完全相同，因此有必要建立適合本地區(qū)的真菌病原生物質譜檢測數(shù)據(jù)庫[16]。目前，MALDI-TOF MS方法只能利用純培養(yǎng)物，無法直接對臨床樣本進行檢測，因此會延長檢測周期[17]。此外，隨著培養(yǎng)條件不同，峰值會發(fā)生一定變化，這增加了檢測標準化的困難程度[18]。

2.3 NGS檢測方法

二代測序(next generation sequencing，NGS)技術通過測定樣本中的全部核酸序列，在全基因組水平上實現(xiàn)耐藥突變位點的檢測，這使臨床核酸序列信息的使用提升到新的水平[19]。利用NGS技術能夠檢測臨床分離株基因組中與耐藥性有關的、可能被靶向DNA序列分析遺漏的新突變類型，在臨床耐藥真菌的檢測方面具有很大潛力。目前它已經(jīng)用于念珠菌中與唑類、棘白菌素類耐藥相關的基因突變檢測[20-22]，但在耐藥煙曲霉鑒定方面的應用較少。Hagiwara等[23]曾經(jīng)利用NGS技術對8株臨床分離的煙曲霉進行耐藥檢測，發(fā)現(xiàn)其中4株攜帶基因突變，其中1株基因組中包含與伊曲康唑耐藥相關的cyp51A(P216L)突變，進一步的檢測發(fā)現(xiàn)了一個11個基因的缺失。而傳統(tǒng)方法(如PCR方法或微衛(wèi)星基因分型)則無法檢測出這些突變。盡管NGS技術在耐藥基因突變檢測方面的優(yōu)勢明顯，但其檢測的精度取決于測序深度，現(xiàn)階段檢測單核苷酸突變的成本較高；另外，臨床樣本尚不能進行直接檢測且對操作人員專業(yè)性的要求很高，這使其在現(xiàn)階段難以在臨床上大規(guī)模應用[24]。

2.4 PCR檢測方法

PCR，即聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)，通過檢測cyp51A基因的典型耐藥突變位點間接反映菌株的耐藥性。

PCR方法中應用最普遍的是實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)與探針熔解曲線技術。在反應體系中加入多條經(jīng)不同熒光基團標記的、覆蓋不同耐藥突變位點的TaqMan探針，待擴增結束后，對產(chǎn)物進行熔解曲線分析。隨著體系中溫度的升高，探針逐漸從模板鏈上脫落，有一半探針脫落時的溫度為該探針與對應模板的Tm值。含有突變堿基的模板與探針的Tm值低于完全匹配的模板，因此能夠通過Tm值的差異鑒定野生型和突變基因；同時，可在一個體系中添加多條探針實現(xiàn)多個耐藥靶點的同時檢測[25]。

目前，基于實時熒光定量PCR方法的煙曲霉唑類耐藥檢測商業(yè)化產(chǎn)品包括AsperGenius?、MycoGenie?和Fungiplex azolus?(見表1)。這三款產(chǎn)品都能直接從臨床樣本中，同時進行曲霉種屬鑒定和煙曲霉耐藥檢測，利用多重熒光PCR方法與熔解曲線分析cyp51A基因的耐藥突變，選擇的靶點分別是TR34/L98H和Y121F/T289A突變(AsperGenius?)、TR34/L98H(MycoGenie?)、TR34和TR46(Fungiplex azolus?)，其中AsperGenius?的靶點最全，對支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)和血液樣本中檢測效果好，對其性能的報道最多。Chong等[26-27]曾經(jīng)在2015年和2016年對AsperGenius?的檢測效果進行報道，在19份來自血液病和ICU患者的BAL樣本中，成功鑒定出16個曲霉陽性樣本，其中14份為煙曲霉。對14份煙曲霉陽性樣本進行耐藥檢測發(fā)現(xiàn)，12份為野生型，1份TR34/L98H突變，1份為TR46/Y121F/T289A突變。另外，在一項對201名疑似IA的血液病患者的多中心的前瞻性研究中，檢出97例曲霉陽性，其中有68例(70%)耐藥PCR鑒定陽性，其中7個樣本中檢測到TR34/L98H突變，1個樣本中檢測到TR46/Y121F/T289A突變，3個樣本中同時檢測到野生型和TR34/L98H突變組合。MycoGenie?缺乏TR46/Y121F/T289A靶點，影響其檢測靈敏性，在呼吸道樣本(n=88)敏感性和特異性為92.9%和90.1%，對于血清樣本的敏感性和特異性為100%和84.6%[28]。qPCR方法無需獲得純的真菌培養(yǎng)物，直接通過擴增臨床樣本中的核酸，即時、快速、高效地對其進行耐藥鑒定。

表1 商業(yè)化煙曲霉唑類耐藥檢測PCR產(chǎn)品[29]Tab.1 Commercial PCR assays for the detection of azole resistance in A. fumigatus

PCR擴增與基因測序聯(lián)合使用也可用于臨床煙曲霉的耐藥檢測。Trama等[30]直接對56份全血樣本進行PCR擴增及焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)2份樣本中含有cyp51A基因的G54突變。另外，一些沒有被探針覆蓋的突變位點可以通過測序方法檢測到；但是與商業(yè)化的qPCR檢測產(chǎn)品相比，測序相對費時費力，不適于大量臨床樣本的檢測。

3 結 論

新型的煙曲霉唑類耐藥檢測方法彌補了藥敏實驗敏感性低、耗時長的不足，但目前MALDI-TOF MS和NGS尚處于技術攻關時期，短期內無法滿足臨床診斷的需求，qPCR技術相對成熟，商業(yè)化的產(chǎn)品靈敏度高、檢測成本低，更適于臨床分級診療。但qPCR方法只能檢測已知的耐藥靶點，隨著對耐藥機制的深入研究，多種檢測技術聯(lián)合使用而形成的多維立體檢測方案，有利于提高對耐藥基因的早期診斷并為臨床用藥提供參考。