皮膚癬菌的分子鑒定技術(shù)研究進(jìn)展

石媛漾 潘煒華 廖萬清 陳顯振 蔡劉陽

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

前 言

皮膚癬菌是臨床最常見的真菌感染之一。全球范圍內(nèi)有20%～25%的人口感染淺部真菌，其中以皮膚癬菌感染為主[1]。目前已報(bào)道的皮膚癬菌有50余種，其中具有人類致病性的有20余種[2]。隨著社會(huì)的發(fā)展，飼養(yǎng)寵物的熱潮、熱帶地區(qū)移民的遷入、人口老齡化的趨勢(shì)和免疫抑制劑的使用等多種因素正使得皮膚癬菌病的發(fā)病率不斷增長(zhǎng)[3]。皮膚癬菌病常伴有不同程度的瘙癢，嚴(yán)重影響身心健康和生活質(zhì)量。目前皮膚癬菌病致病菌種的鑒定仍以直接鏡檢和真菌培養(yǎng)的經(jīng)典方法為主，耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果受主觀因素影響大，因此，快速準(zhǔn)確地鑒定致病菌種，能為精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。新興的分子鑒定技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、特異的優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地滿足臨床診治需要。然而，皮膚癬菌病分子診斷仍面臨三方面挑戰(zhàn)[4]：①DNA提取濃度低；②標(biāo)記基因或組合分辨率不夠高，分類體系尚不完善；③需要尋找敏感性或特異性更強(qiáng)的擴(kuò)增體系。本文回顧了近二十年來國內(nèi)外文獻(xiàn)，介紹皮膚癬菌的分子鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 皮膚癬菌標(biāo)記基因和分類學(xué)進(jìn)展

相近的皮膚癬菌種屬有相似的形態(tài)學(xué)特征，形態(tài)學(xué)鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要豐富的菌學(xué)知識(shí)，DNA測(cè)序?yàn)闇?zhǔn)確鑒定菌種提供了最佳途徑[5]。由于從臨床樣本中提取的真菌DNA濃度有限，標(biāo)記基因的選擇和分子鑒定技術(shù)的方式?jīng)Q定了DNA檢測(cè)的靈敏度[6]。

自20世紀(jì)以來，分子生物學(xué)的發(fā)展為皮膚癬菌的分類和進(jìn)化提供了更多有價(jià)值的背景信息。目前的NCBI數(shù)據(jù)庫存在大量不同名稱的相同序列或錯(cuò)誤識(shí)別的序列[7]，這個(gè)漏洞可以通過皮膚癬菌網(wǎng)(http://www.cbs.knaw.nl/dermatophytes/DefaultPage.aspx)上實(shí)時(shí)更新的ITS序列數(shù)據(jù)庫來填補(bǔ)[8]。

根據(jù)最新的真菌分類證據(jù)[2]，皮膚癬菌劃分為9個(gè)屬，分別為毛癬菌屬(Trichophyton)(16個(gè)種)、表皮癬菌屬(Epidermophyton)(1個(gè)種)、奈尼茲菌屬(Nannizzia)(9個(gè)種)、小孢子菌屬(Microsporum)(3個(gè)種)、節(jié)皮菌屬(Arthroderma)(21個(gè)種)、Paraphyton(3個(gè)種)、Lophophyton(1個(gè)種)、Cenomyces(1個(gè)種)、Guarromyces(1個(gè)種)，此分類體系是目前較為標(biāo)準(zhǔn)的一套皮膚癬菌分類體系。選擇合適的標(biāo)記基因有利于病原微生物的確切鑒定，例如，高度保守的CHS1基因一直是常用的標(biāo)記基因[9-10]；28S rDNA序列雖區(qū)分度較低也可適用于皮膚癬菌鑒定[11]；現(xiàn)有的分子方法主要針對(duì)18S、ITS1、5.8S、ITS2和26S序列側(cè)翼的rDNA區(qū)域；此外，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因[12]、微衛(wèi)星標(biāo)記[13]、β-微管蛋白(BT2)[14-15]、翻譯延長(zhǎng)因子1-α(Tef-1α)[14,16]、鈣調(diào)蛋白基因CaM[17]等都具有高度特異性。其中，網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上ITS序列上傳量最豐富，因此有研究者把基于ITS的測(cè)序技術(shù)當(dāng)作皮膚癬菌系統(tǒng)發(fā)育分析和鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。但是，也有研究表明，對(duì)于相似相近菌種的精細(xì)分辨，ITS仍具有局限性[18]。

總的來說，單個(gè)基因劃分物種邊界的能力有限，尋找多個(gè)標(biāo)記基因進(jìn)行多重鑒定和反復(fù)驗(yàn)證是必不可少的。

2 基于PCR的分子鑒定技術(shù)

2.1 常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

常規(guī)PCR是使用最廣泛、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的一種分子技術(shù)。皮膚癬菌的鑒定，主要選擇ITS、rDNA、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ或CHS1等序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。Gordon等[3]研究了107個(gè)臨床樣本，結(jié)果顯示常規(guī)PCR能夠應(yīng)用于區(qū)別皮膚癬菌和其他混合感染的微生物。但是，常規(guī)PCR對(duì)溫度條件、實(shí)驗(yàn)室空間和設(shè)備的依賴性強(qiáng)，結(jié)果受多種因素影響，已逐漸地被更先進(jìn)的技術(shù)替代。

2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)

RT-PCR是一種使用不同的特異性引物，結(jié)合探針作為染料，直接從臨床樣本中檢測(cè)出一種或多種皮膚癬菌的分子方法。它的特點(diǎn)是處理時(shí)間短、污染率低，缺點(diǎn)是成本較高。Bergmans等[20]和Alexander等[21]基于ITS1引物，區(qū)分了包括毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬的11種皮膚癬菌，將皮膚癬菌鑒定精確到屬種水平。另一項(xiàng)研究報(bào)道，RT-PCR使臨床樣本中皮膚癬菌的檢測(cè)率顯著提高到97%[22]。Miyajima等[23]在研究甲真菌病時(shí)開發(fā)了一種新的RT-PCR方法，成功檢測(cè)出紅色毛癬菌、須癬毛癬菌和多種非皮膚癬菌致病真菌。

2.3 巢式PCR(nest-PCR)

巢式PCR技術(shù)由初級(jí)和次級(jí)擴(kuò)增組成，初級(jí)擴(kuò)增的產(chǎn)物用作次級(jí)擴(kuò)增的模板，以提高特異度和靈敏度[24]。據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，巢式PCR結(jié)合CHS1基因診斷皮膚癬菌病的靈敏度為83.8%[25-26]。另有研究利用巢式PCR結(jié)合多個(gè)標(biāo)記基因(ITS+ITS1+5.8S rRNA基因+ITS2)檢測(cè)貓和犬組織樣本中的皮膚癬菌，結(jié)果顯示更高的特異度(94.4%)和靈敏度(94.9%)[27]。巢式PCR也有其缺點(diǎn)，Petinataud等[28]指出，因其涉及兩次擴(kuò)增步驟，污染風(fēng)險(xiǎn)更高。

2.4 多重PCR(mutiplex-PCR)

多重PCR指的是在單個(gè)PCR反應(yīng)體系中快速完成多個(gè)靶序列擴(kuò)增，以提高檢測(cè)效率。多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是避免引物二聚體的產(chǎn)生，從而避免擴(kuò)增失敗和非特異性擴(kuò)增。Arabatzis等[29]開發(fā)了雙重RT-PCR，結(jié)合ITS1和ITS2序列，直接檢測(cè)臨床樣本中的皮膚癬菌。丹麥的Statens Serum研究所[30]開發(fā)了一種商業(yè)雙重PCR試劑盒，針對(duì)CHS1和ITS2基因，能夠在5 h內(nèi)從指甲樣本中檢測(cè)出紅色毛癬菌。據(jù)報(bào)道，多重PCR技術(shù)鑒定指甲樣本中的紅色毛癬菌和須癬毛癬菌的敏感性為97%，而傳統(tǒng)方法的敏感性為81.1%[19]。當(dāng)前在許多國家，雙重PCR主要用于檢測(cè)甲真菌病和足癬中的紅色毛癬菌[12，20]。

2.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)是一種擴(kuò)增含有小規(guī)模遺傳變異的核酸的特定片段，然后用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理，根據(jù)片段的電泳結(jié)果進(jìn)行鑒定的技術(shù)。早期，PCR-RFLP用于鑒定組織樣本中特定的真菌，例如毛癬菌屬、鐮刀菌屬或曲霉屬。目前，PCR-RFLP已經(jīng)能夠直接從指甲、皮膚或頭發(fā)樣本中成功檢測(cè)到紅色毛癬菌和須癬毛癬菌[31]。一項(xiàng)研究指出，PCR-RFLP在74%的甲真菌病培養(yǎng)陰性樣本中檢測(cè)到毛癬菌屬和12種非皮膚癬菌[32]。PCR-RFLP技術(shù)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、不依賴先進(jìn)的儀器設(shè)備，但是需要限制性內(nèi)切酶、操作復(fù)雜以及耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用[33]。

3 恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

近年來，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)快速發(fā)展，該技術(shù)將反應(yīng)過程維持在恒定的溫度，通過添加不同活性的酶和特異性引物來達(dá)到快速擴(kuò)增核酸的目的。當(dāng)前已研發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)分為兩大類[34]：①通過增加核酸濃度從而加強(qiáng)分析結(jié)果的信號(hào)，如LAMP、NASBA、HDA、EXPAR、SDA、RPA、RCA；②無需改變核酸濃度就能加強(qiáng)分析信號(hào)，如EASA、ICSDP、HCR、CHA等。

與PCR相比，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)表現(xiàn)出更高的特異度和靈敏度，目前已成功地應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。LAMP是目前應(yīng)用最廣泛的篩選技術(shù)，用于鑒定皮膚癬菌、結(jié)核分枝桿菌、禽流感病毒[35-36]、瘧原蟲[37]等病原體；NASBA用于檢測(cè)mRNA和microRNAs[38]；EXPAR能檢測(cè)蛋白質(zhì)大分子[39-40]；SDA可以分析含有多種成分的樣品，如含有細(xì)菌和病毒的人體血液[34]；RPA能直接在生物樣品中檢測(cè)陽離子以檢測(cè)不同的病原體[41]。RCA[42]、HDA[34]廣泛用于微生物感染的診斷，鄧淑文等[43]利用RCA區(qū)分了頭癬中的紫色毛癬菌和犬小孢子菌；HCR[44]技術(shù)，可用于測(cè)定細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的microRNAs[45]和鑒定腫瘤細(xì)胞[34]；EASA技術(shù)，可用于提高熒光、電化學(xué)、核糖核酸、特異性酶分析的靈敏度[34]；新穎的Y結(jié)探針技術(shù)[46]和基于特定雙鏈的技術(shù)[47]結(jié)合電化學(xué)法，可用于檢測(cè)DNA、RNA和其他化學(xué)物質(zhì)；CHA技術(shù)，可用于分析microRNAs[48]。

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要解決的問題在于減少非特異性反應(yīng)的發(fā)生，減少假陰性或假陽性結(jié)果。目前恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)還處于研發(fā)和改善階段，需要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上開發(fā)適用性更好、精確度更高、選擇性更強(qiáng)的技術(shù)方法。

4 MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù))

MALDI-TOF MS是一種基于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)，能夠直接測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖等生物大分子。該技術(shù)通過分析和比對(duì)特定的微生物蛋白質(zhì)圖譜，能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地鑒定微生物，且成本較低，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)皮膚癬菌等真菌[49-50]。有研究者利用MALDI-TOF MS快速鑒別近300株皮膚癬菌，發(fā)現(xiàn)PCR和MALDI-TOF MS鑒定的符合率分別為99.3%和98.8%[49]。另一項(xiàng)研究[51]評(píng)估了2008至2015年間發(fā)表的十個(gè)項(xiàng)目，發(fā)現(xiàn)基于MALDI-TOF MS的皮膚癬菌鑒定的準(zhǔn)確率在14%至100%之間，差異大的原因可能是樣本的處理、提取步驟的操作和數(shù)據(jù)庫的不足，再加上皮膚癬菌在分類學(xué)方面的演變。因此，對(duì)于皮膚癬菌等絲狀真菌，MALDI-TOF MS的主要限制因素在于參考數(shù)據(jù)庫的資料有限[52]，需要及時(shí)地持續(xù)地更新廣譜數(shù)據(jù)庫，才能更高效地鑒定皮膚癬菌。

5 總結(jié)與展望

皮膚癬菌病是臨床最常見的皮膚真菌感染性疾病之一，經(jīng)典診斷方法已經(jīng)無法滿足臨床診治的需求。新興的分子鑒定技術(shù)具有高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為皮膚癬菌的快速鑒定和精準(zhǔn)診治帶來了新的希望，同時(shí)，也有利于尋找分辨率更高的皮膚癬菌標(biāo)記基因，完善皮膚癬菌的分類學(xué)體系，推動(dòng)真菌分類學(xué)的發(fā)展。不同的分子鑒定技術(shù)有著各自的特點(diǎn)，常規(guī)PCR使用最廣泛，簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)；RT-PCR處理時(shí)間短，污染率低；巢式PCR有著高特異度和靈敏度；多重PCR檢測(cè)效率極高；PCR-RFLP非常簡(jiǎn)便；不斷完善的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)為核酸擴(kuò)增和病原體鑒定提供了新途徑；基于蛋白質(zhì)組學(xué)的MALDI-TOF MS也能夠高效特異地鑒定皮膚癬菌。不同的分子技術(shù)適用于不同的研究條件，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，結(jié)合經(jīng)濟(jì)條件、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、研究策略等選擇合適的技術(shù)方法。未來，基于分子鑒定技術(shù)的各類檢測(cè)體系研發(fā)將是分子生物學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)，分子鑒定技術(shù)將不斷進(jìn)步，做到更快速、更簡(jiǎn)便、更準(zhǔn)確、更實(shí)惠，幫助皮膚癬菌病患者解決病痛。