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    八寶豆豉制曲過程中微生物多樣性與蛋白酶活性的動(dòng)態(tài)變化及其潛在相關(guān)性

    2023-01-07 14:34:02張彥贈(zèng)湯曉娟林祥娜紀(jì)艷青賀紅軍楊宏專劉云國
    中國釀造 2022年12期
    關(guān)鍵詞:制曲八寶豆豉

    張彥贈(zèng),湯曉娟,林祥娜,紀(jì)艷青,賀紅軍,楊宏專,劉云國*

    (1.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 臨沂 276000;2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005;3.臨沂惟一齋醬園,山東 臨沂 276000)

    豆豉作為中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一,因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和爽膩的口感,受到了眾多人們的喜愛,被廣泛用作調(diào)味品和開胃菜[1]。豆豉富含多種功能活性物質(zhì),具有抗氧化活性、抗糖尿病活性和降壓活性等藥用特性[2-3],成為了目前眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。通常豆豉按照制曲階段中主要發(fā)酵微生物的類型分為細(xì)菌型、毛霉型、曲霉型、根霉型豆豉,其中,細(xì)菌型豆豉是指在制曲過程中沒有采用人工發(fā)酵菌種接種于煮熟后的大豆,而是以散落在室內(nèi)空氣中的微生物進(jìn)行自然接種[4]。八寶豆豉就是細(xì)菌型豆豉的一種,是一種純自發(fā)的、完全依靠本地特有的微生物進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)品。相傳八寶豆豉起源于清朝,興起于山東臨沂,現(xiàn)已成為臨沂當(dāng)?shù)匾环N地方特色食品,是當(dāng)?shù)厝藗儽夭豢缮俚募页2?。簡單來說八寶豆豉是集黑豆、茄子、鮮姜、花椒、紫蘇葉、杏仁、白酒、香油八種原料為一體,制作時(shí)先將大豆進(jìn)行初發(fā)酵,即所謂的制曲,同時(shí)將其他配料進(jìn)行初步的加工和腌制,并按一定的配方,將這八種原料進(jìn)行混合,在發(fā)酵缸中密封,進(jìn)行露天發(fā)酵,即進(jìn)入后發(fā)酵階段,經(jīng)過1年多的后發(fā)酵即可成熟。成熟的豆豉色澤亮麗,醇厚清香,食之開胃,去膩爽口。由于集齊八種原料進(jìn)行發(fā)酵,故名八寶豆豉[5-6]。

    就八寶豆豉制曲過程而言,利用當(dāng)?shù)靥赜械奈⑸镌陂_放的曲房中對大豆初步分解,大豆中的營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪等進(jìn)行初步降解,形成小分子物質(zhì),并產(chǎn)生各種酶類,為后發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行分解奠定基礎(chǔ),也是決定后發(fā)酵產(chǎn)生各種功能成分和風(fēng)味優(yōu)劣的關(guān)鍵[7]。因此,制曲過程極大的影響著八寶豆豉產(chǎn)品的質(zhì)量。然而在這種開放制曲的環(huán)境中,各種復(fù)雜微生物都會(huì)參與該過程,包括有利于發(fā)酵的,不利于發(fā)酵的,甚至對人體有害的,且這種純自發(fā)的方式,很容易受到來自氣候條件、工人的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)、本地的微生物等條件影響[8],導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量往往參差不齊,難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、安全化生產(chǎn),亟需改進(jìn)傳統(tǒng)工藝,篩選出益酵菌株,進(jìn)行純種發(fā)酵。因此,獲得八寶豆豉制曲中的微生物群落演替信息具有重要的意義。李華等[9]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對八寶豆豉中的優(yōu)勢菌進(jìn)行分離和鑒定,結(jié)果顯示優(yōu)勢菌全部為芽孢桿菌屬(Bacillus)。然而傳統(tǒng)培養(yǎng)法在全面揭示豆豉微生物信息上局限性比較大[10]。近幾年,高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物菌群動(dòng)態(tài)研究。如王娜等[11]利用高通量測序技術(shù)對貴州3種不同類型的細(xì)菌型豆豉進(jìn)行研究,并鑒定出3類豆豉均以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬;馬上超等[12]同樣利用高通量技術(shù)對5種淡豆豉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究,并鑒定出5種優(yōu)勢菌屬。可見相較于傳統(tǒng)培養(yǎng),高通量測序技術(shù)研究微生物演替規(guī)律能夠更加全面和成熟。然而,針對于八寶豆豉的有關(guān)微生物演替的研究卻少有報(bào)道。

    因此,本研究通過高通量測序技術(shù)對八寶豆豉制曲過程中的微生物群落演替規(guī)律進(jìn)行研究,進(jìn)而揭示制曲過程中的優(yōu)勢微生物。同時(shí),由于制曲階段微生物所產(chǎn)的蛋白酶對賦予豆豉良好口味和功能活性具有重要作用[13]。因此,對制曲期間的蛋白酶活性,包括酸性、中性、堿性蛋白酶活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)測定,并通過皮爾森(Pearson)相關(guān)性分析探索與高產(chǎn)蛋白酶活相關(guān)的潛在優(yōu)勢菌屬,旨在為探索符合制曲要求的優(yōu)勢菌屬,以及篩選高產(chǎn)蛋白酶的菌種提供基礎(chǔ)理論。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    豉曲:臨沂市唯一齋醬園;E.Z.N.ATMMag-Bind Soil脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)Kit:上海索寶生物科技有限公司;Qubit3.0 DNA檢測試劑盒:上海玉博生物科技有限公司;2×HieffRobust聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads:上海翊圣生物科技有限公司;Folin試劑、磷酸二氫鈉、三氯乙酸(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉(均為分析純):天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;干酪素、乳酸、硼砂(均為分析純):天津市福晨化學(xué)試劑廠;酪氨酸(分析純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;氫氧化鈉(分析純):天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;乳酸鈉(分析純):天津市鼎盛鑫有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HWS-24電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Pico-21臺式離心機(jī):Thermo Fisher公司;GL-88B漩渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;TND03-H-H混勻型干式恒溫器:深圳拓能達(dá)科技有限公司;DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽:北京市六一儀器廠;FR-1000凝膠成像系統(tǒng):上海復(fù)日科技有限公司;Q32866 Qubit3.0熒光計(jì):Invitrogen;ETC 811 PCR儀:北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 八寶豆豉曲的制作

    由于豆豉的制作受季節(jié)的影響較大,需在每年的6~7月進(jìn)行。制曲工藝流程[6]:

    黑豆清洗→常壓蒸煮→晾曬→曲房制曲→晾曬洗曲→豉曲

    操作要點(diǎn):

    常壓蒸煮:用清水進(jìn)行常壓蒸煮,料水比為1∶1(50 kg黑豆∶50 kg水),煮制黑豆八分熟,時(shí)間約30 min。

    晾曬:將蒸煮完成的黑豆均勻攤曬在篩網(wǎng)上,在陽光下瀝干水分。

    曲房制曲:將晾曬好的黑豆均勻的分?jǐn)傇谇厣希穸燃s3 cm為宜,曲房溫度控制在35~37 ℃,必要時(shí)進(jìn)行加熱升溫或通風(fēng)降溫。發(fā)酵約5 d后,待黑豆上面布滿密集的“黃毛”,即制曲完成。

    晾曬洗曲:將發(fā)酵好的黑豆均勻攤曬在篩網(wǎng)上,在陽光下進(jìn)行晾曬、翻動(dòng)。待“黃毛”極易脫落,即曬至完成。后用篩網(wǎng)篩動(dòng)黑豆、搓掉“黃毛”,用涼透的開水再洗去黑豆表面殘余的“黃毛”,盡快撈出,晾曬干備用。即得豉曲。

    1.3.2 八寶豆豉曲的取樣

    在曲房制曲中,從第一天進(jìn)行取樣,每隔24 h取一次樣,直至制曲結(jié)束。每次取樣時(shí),分別取上、中、下位置,每個(gè)位置取3次,并充分混合,作為一個(gè)代表樣本。共計(jì)5個(gè)樣本,分別命名為D1、D2、D3、D4、D5,同時(shí)這些樣本也代表了制曲階段的5個(gè)不同時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)所用的豉曲取自臨沂市唯一齋醬園。

    1.3.3 豉曲樣品微生物菌群的高通量測序

    基因組DNA的提?。悍Q取3 g豆豉樣品,加入液氮研磨至細(xì)粉,稱取0.3 g細(xì)粉于樣品管,在組織破碎儀中進(jìn)行破碎,按照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒提取宏基因組DNA。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性以及Qubit定量檢測DNA樣本濃度。

    PCR擴(kuò)增:以提取的基因組DNA為模板,選用正向引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3)'和反向引物805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3)'對細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用正向引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)'和反向引物ITS2(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)'對真菌ITS1-ITS2區(qū)域基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第一輪PCR擴(kuò)增體系:2×HieffRobust PCR Master Mix 15 μL,正反向引物各1 μL,DNA模板25 ng,補(bǔ)雙蒸水(ddH2O)至總體系30 μL;PCR擴(kuò)增條件:94 ℃、3min;94 ℃、30 s,45℃、20 s,65 ℃、30 s,5個(gè)循環(huán);94 ℃、20 s,55 ℃、20 s,72 ℃、30 s,20個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min。第二輪PCR擴(kuò)增體系:2×HieffRobust PCR Master Mix 15 μL,正反向引物各1 μL,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL,補(bǔ)ddH2O至總體積30 μL;PCR擴(kuò)增條件:95 ℃、3 min;94 ℃、20 s,55 ℃、20 s,72 ℃、30 s,5個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小以及Qubit定量檢測文庫樣本濃度。

    高通量測序:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工有限公司,采用Illumina MiseqTM平臺進(jìn)行二代測序。

    1.3.4 蛋白酶活的測定

    參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[14]中的福林法測定蛋白酶活性。

    1.3.5 數(shù)據(jù)處理

    采用Illumina MiSeq PE300對高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,按照97%的相似性進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類分析、物種注釋、Alpha多樣性分析。細(xì)菌通過RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)和GTDB數(shù)據(jù)庫(https://gtdb.ecogenomic.org/)進(jìn)行分類;真菌使用基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對UNITE(http://unite.ut.ee/index.php)數(shù)據(jù)庫。采用R語言(V 4.0.0)繪制稀釋曲線、香農(nóng)指數(shù)曲線、主坐標(biāo)和層級聚類圖;采用Origin2021(v 9.8.0.200)繪制蛋白酶活變化曲線圖;采用聯(lián)川生物平臺(https://www.omicstudio.cn/tool)繪制皮爾森相關(guān)性熱圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 八寶豆豉制曲階段微生物菌群高通量測序結(jié)果及Alpha多樣性分析結(jié)果

    為了解每個(gè)樣本測序信息是否具有代表性,對樣本的有效序列進(jìn)行稀釋曲線分析和香農(nóng)曲線分析,結(jié)果見圖1。

    由圖1可知,細(xì)菌和真菌菌群的稀釋曲線和香農(nóng)曲線都隨著測序量的增大逐漸趨于平緩,細(xì)菌和真菌菌群的多樣性也不會(huì)隨著測序量的增加而變化[15-16],說明本次測序量合理,足夠代表整個(gè)樣本的微生物多樣性信息,并可以進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。對八寶豆豉制曲過程中5個(gè)不同時(shí)期的樣品進(jìn)行高通量測序后,按照97%以上的相似水平對所有序列進(jìn)行OTU劃分,并進(jìn)行α-多樣性分析,結(jié)果見表1。

    圖1 八寶豆豉制曲階段細(xì)菌及真菌菌群的稀釋曲線(a、c)和香農(nóng)曲線(b、d)Fig.1 Dilution curves (a,c) and Shannon curves (b,d) of bacterial and fungal flora during the koji-making process of Ba-bao Douchi

    由表1可知,通過高通量測序共獲得260 317條細(xì)菌、264 408條真菌序列,按照97%以上的相似水平對所有序列進(jìn)行OTU劃分,得到67個(gè)細(xì)菌OTUs和105個(gè)真菌OTUs。Chao1指數(shù)是用來衡量一個(gè)群落中物種豐度的指標(biāo),且與物種豐度變化呈正相關(guān)[17]。在整個(gè)制曲階段,細(xì)菌菌群的Chao1指數(shù)以及OTUs整體呈現(xiàn)上升的趨勢,并且整體變化較穩(wěn)定。值得注意的是,在制曲第4天時(shí),細(xì)菌群落達(dá)到最高的豐度,說明第4天的細(xì)菌菌群微生物豐度最高。而真菌菌群與細(xì)菌菌群相反,真菌菌群在第4天達(dá)到了最低的物種豐度。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來衡量群落多樣性的指數(shù),其中Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正比關(guān)系,而Simpson指數(shù)與群落多樣性呈反比關(guān)系[18]。制曲期間,細(xì)菌菌群的Shannon指數(shù)遠(yuǎn)高于真菌菌群,說明在制曲階段,細(xì)菌菌群的多樣性高于真菌菌群的多樣性[19]。同時(shí)值得注意的是,在制曲第4天,細(xì)菌和真菌菌群的多樣性最低??偟膩碚f,在整個(gè)制曲過程中,細(xì)菌和真菌菌群的豐度和多樣性均發(fā)生了明顯的變化。推測這可能是因?yàn)榄h(huán)境如發(fā)酵酸度及營養(yǎng)條件如水分等因素發(fā)生變化,以及某些微生物,與其自身及其他微生物存在一定的競爭作用等[20-21]。

    表1 八寶豆豉制曲階段樣品的高通量測序結(jié)果及Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Result of high-throughput sequencing and Alpha diversity analysis of Ba-bao Douchi samples during the koji-making process

    2.2 基于屬水平八寶豆豉制曲階段微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

    制曲階段,豆豉樣本中的微生物菌群在屬水平上共注釋到45個(gè)細(xì)菌屬和83個(gè)真菌屬,其中6個(gè)菌屬被確定為優(yōu)勢細(xì)菌屬(相對豐度>1%),3個(gè)菌屬被確定為優(yōu)勢真菌屬(相對豐度>1%)[22],結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,在制曲階段,優(yōu)勢細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、亞硝化單胞菌屬(Streptophyta)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus),其中以芽孢桿菌屬(Bacillus)為主,平均相對豐度為57.22%。芽孢桿菌可產(chǎn)生大量的酶,如蛋白酶、淀粉酶,可以加速豆豉的發(fā)酵過程,并提供其他細(xì)菌所需的物質(zhì)[23],因此,芽孢桿菌屬在制曲階段對物質(zhì)的分解和產(chǎn)酶方面具有關(guān)鍵的作用。另外其他優(yōu)勢細(xì)菌屬的相對豐度也有明顯的變化,如Streptophyta和Acinetobacter的相對豐度呈逐漸減少的趨勢,推測可能是由于這兩類菌屬對制曲環(huán)境適應(yīng)較弱的原因。Pseudomonas則整體呈現(xiàn)增加的趨勢,至發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對豐度達(dá)11.38%,該菌屬也是以往對豆豉的研究中較為常見的菌屬[24]。據(jù)報(bào)道,大部分Pseudomonas能產(chǎn)生更多種類的蛋白酶、脂肪酶和卵磷脂酶[25],因此,其對于豆豉品質(zhì)的形成發(fā)揮著重要作用。

    圖2 基于屬水平八寶豆豉制曲階段細(xì)菌(A)和真菌(B)群落組成Fig.2 Community composition of bacteria (A) and fungi (B) during the koji-making process of Ba-bao Douchi based on genus level

    由圖2亦可知,在真菌微生物菌群組成中,菌屬較為單一,優(yōu)勢真菌屬包括曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、根霉屬(Rhizopus),其中Aspergillus以絕對的優(yōu)勢占據(jù)了整個(gè)發(fā)酵過程,制曲結(jié)束時(shí),相對豐度達(dá)到99.66%,說明該菌屬是制曲階段真菌微生物的主要優(yōu)勢菌屬,同時(shí)推測八寶豆豉在制曲時(shí)黑豆上逐漸布滿“黃毛”,這種“黃毛”的出現(xiàn)可能與該菌屬存在密切的關(guān)系。據(jù)研究報(bào)道,真菌微生物,尤其是曲霉屬,是蛋白酶的最重要來源,具有比較高的產(chǎn)蛋白酶活的能力,是導(dǎo)致發(fā)酵食品中蛋白質(zhì)發(fā)生降解的主要因素[26]。

    2.3 八寶豆豉制曲階段微生物菌群結(jié)構(gòu)差異分析

    基于屬水平,采用主坐標(biāo)分析和層級聚類分析對八寶豆豉制曲過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行分析,結(jié)果見圖3。

    由圖3a和3b可知,細(xì)菌菌群的PCoA1(52.08%)和PCoA2(27.08%)累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)79.16%,真菌菌群的PCoA1(94.8%)和PCoA2(5.12%)累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.92%,說明都可以較好的代表不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析中,樣品D1和D3較為接近,樣品D4與D5較為接近,D2樣本則距離其他樣本較遠(yuǎn)。而真菌群落的主坐標(biāo)分析中,樣品D1、D2、D3均距離彼此較遠(yuǎn),分散于不同象限中,只有樣品D4和D5位于同一象限,距離較為接近,說明這兩個(gè)時(shí)期菌落結(jié)構(gòu)較為相似。

    圖3 八寶豆豉制曲階段細(xì)菌及真菌菌群的主坐標(biāo)分析(a、b)和層級聚類分析(c、d)結(jié)果Fig.3 Result of principal coordinate analysis (a,b) and hierarchical cluster analysis (c,d) of bacterial and fungal flora during the koji-making process of Ba-bao Douchi

    由圖3c可知,5個(gè)時(shí)期的樣本被聚類成3個(gè)階段,分別為D1和D3、D2、D4和D5,與主坐標(biāo)分析一致。由圖3d可知,樣品D1、D2、D3均處于不同的分支,樣品D4與D5處于同一分支,說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行,每個(gè)時(shí)期的樣本逐漸的發(fā)生變化,并在D4~D5時(shí)期趨向于穩(wěn)定,這也與主坐標(biāo)分析結(jié)果一致。

    總體來說,隨著制曲時(shí)間的變化,八寶豆豉的微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化,尤其在前三個(gè)時(shí)期(D1、D2、D3)菌群結(jié)構(gòu)變化差異明顯,在后兩個(gè)時(shí)期(D4和D5),菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

    2.4 八寶豆豉制曲階段蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化

    八寶豆豉制曲過程中,蛋白酶活力的變化趨勢見圖4。

    圖4 八寶豆豉制曲階段3種蛋白酶活力的變化Fig.4 Change of three kinds of proteases activity during the koji-making process of Ba-bao Douchi

    由圖4可知,在制曲過程中,中性蛋白酶在初期增長較緩慢,而后期增長較快,并在發(fā)酵5 d時(shí)達(dá)到最高,為(867.05)U/g。堿性蛋白酶在整個(gè)制曲過程中呈增長的趨勢,并在發(fā)酵5 d時(shí)達(dá)到最高,為(606.46)U/g。而酸性蛋白酶活力則在前期增長較緩慢,在發(fā)酵3~4 d時(shí)快速增加,而后出現(xiàn)降低的趨勢,推測出現(xiàn)降低的原因可能是由于后期產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物不再適宜生長??傮w來說,整個(gè)制曲階段,堿性和中性蛋白酶是制曲階段的主要酶,說明豉曲微生物主要以產(chǎn)中性和堿性蛋白酶的微生物為主。索化夷等[27]研究發(fā)現(xiàn),永川豆豉制曲階段的主要蛋白酶為中性和堿性蛋白酶,且永川豆豉也采用的是自然開放式制曲的方式,不同的是永川豆豉八寶豆豉的制曲工藝存在較大差異;代麗嬌等[28]采用人工接種方式,將枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種于蒸煮后的大豆進(jìn)行制曲,結(jié)果發(fā)現(xiàn),制曲過程中以中性蛋白酶活為主,且遠(yuǎn)高于酸性蛋白酶活。

    據(jù)研究報(bào)道,蛋白酶活的種類會(huì)對豆豉的品質(zhì)有重要影響,若豆豉中性蛋白酶活力高,則得到的豉曲更易被后期微生物進(jìn)行降解,產(chǎn)生的風(fēng)味和口感較好;若以堿性和酸性為主,則生產(chǎn)出的豆豉偏苦和偏酸[29]。因此,若生產(chǎn)出豆豉出現(xiàn)偏苦的口感時(shí),極有可能是與堿性蛋白酶分泌旺盛有關(guān)。

    2.5 八寶豆豉優(yōu)勢微生物屬與蛋白酶活相關(guān)性分析

    在利用高通量技術(shù)確定制曲階段優(yōu)勢微生物屬的基礎(chǔ)上,結(jié)合蛋白酶活變化,利用皮爾森相關(guān)性分析建立了優(yōu)勢微生物屬與蛋白酶活的關(guān)系[30-31],旨在探索與高產(chǎn)蛋白酶相關(guān)的菌屬,結(jié)果見圖5。

    圖5 八寶豆豉制曲階段優(yōu)勢微生物屬與蛋白酶活的皮爾森相關(guān)性分析熱圖Fig.5 Heat map of Pearson correlation analysis of dominant microbial genera and protease activity during the koji-making process of Ba-bao Douchi

    由圖5可知,中性蛋白酶活力主要與Bacillus、Aspergillus以及Staphylococcus呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān),說明在產(chǎn)中性蛋白酶活方面,這3種菌屬可能具有一定的貢獻(xiàn)。酸性蛋白酶主要與Bacillus和Aspergillus呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,尤其是Bacillus,作為環(huán)境中較常見的細(xì)菌屬[32],該菌屬可能在產(chǎn)酸性蛋白酶上具有一定的貢獻(xiàn)。堿性蛋白酶與Aspergillus呈現(xiàn)較為顯著的正相關(guān)(P<0.05),因此,推測該菌屬可能在產(chǎn)堿性蛋白酶活方面要優(yōu)于其他菌屬。整體來說,3種蛋白酶活主要與4種菌屬表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系,分別是Bacillus、Aspergillus、Staphylococcus以及Pseudomonas,因此,推測這4種菌屬可能在蛋白酶活的產(chǎn)生上有重要作用。另外其他菌屬在制曲階段中呈現(xiàn)出與3種蛋白酶活負(fù)相關(guān)的趨勢,說明這些優(yōu)勢菌屬可能在產(chǎn)蛋白酶活方面貢獻(xiàn)較小,甚至是無關(guān)菌屬。當(dāng)然,上述所提到與蛋白酶活性有關(guān)的菌屬是否具有確切的作用,仍然需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

    3 結(jié)論

    本研究通過高通量測序技術(shù)研究了八寶豆豉制曲過程中的微生物菌群多樣性,結(jié)果顯示,制曲期間細(xì)菌菌群的多樣性高于真菌菌群多樣性,并且隨著制曲的進(jìn)行,微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化,發(fā)酵使得微生物演替較為劇烈。直到制曲階段后期(D4~D5)達(dá)到平穩(wěn)。在制曲階段,共確定出9種優(yōu)勢微生物屬(相對豐度>1%),包括6種細(xì)菌屬,3種真菌屬,其中Bacillus和Aspergillus是占主導(dǎo)地位的優(yōu)勢微生物屬。蛋白酶活分析結(jié)果顯示,在制曲階段中,堿性和中性蛋白酶活均呈增加趨勢,且在制曲結(jié)束時(shí)達(dá)到最高活力,為制曲階段的主要蛋白酶活。優(yōu)勢微生物屬與蛋白酶活的皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示,Bacillus、Aspergillus、Staphylococcus以及Pseudomonas這4種優(yōu)勢菌屬與蛋白酶活性呈現(xiàn)正相關(guān),而其他優(yōu)勢微生物均與蛋白酶活的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究為進(jìn)一步篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株以及揭示制曲階段發(fā)酵機(jī)理提供了基礎(chǔ)的理論,也為后期開發(fā)優(yōu)良微生物資源、提高豆豉質(zhì)量和食用安全性提供了一定的指導(dǎo)。

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