HPLC法測(cè)定復(fù)方保健酒中人參皂苷和西紅花苷的含量

胡 楊，李先芝，2*，嚴(yán) 玲，毛瓊麗，劉 洋，朱 艷，石 豪

（1.勁牌有限公司，湖北 黃石 435100；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435100）

保健酒是將我國(guó)酒文化和中藥文化有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物，是我國(guó)特有的現(xiàn)象。保健酒是以白酒為基酒，以單味或多味中藥材為原料，精制而成的一種具有某些功能性的酒。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，消費(fèi)者越來(lái)越注重健康的生活方式，保健酒愈發(fā)受到消費(fèi)的青睞。因此，保健酒成為眾多研究者和學(xué)者的研究對(duì)象。謝洪等[1-2]以青錢(qián)柳為原料，探究了青錢(qián)柳保健酒的生產(chǎn)工藝，確認(rèn)最佳的工藝條件。許明君等[3]以肉蓯蓉、枸杞子、紅參、菟絲子等4味藥材為原料，研究出了具有增強(qiáng)免疫力的復(fù)方中藥保健酒。與此同時(shí)，那廣寧等[4]以苦瓜汁與蘋(píng)果菠蘿混合果汁為原料研究出了一種發(fā)酵型苦瓜保健酒，研究結(jié)果表明，該保健酒具有一定的抗氧化活性。

復(fù)方保健酒是以多種中藥材為原料，以中藥材的配伍合理性為基礎(chǔ)而研究的保健酒[5-7]。本文研究的復(fù)方保健酒是以人參、西紅花、葛仙米3味藥材為原料，經(jīng)過(guò)數(shù)字化提取精制而成的具有提高免疫力的保健酒?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明人參在抗炎[8-9]、增強(qiáng)免疫力[10-11]、降血脂[12]、護(hù)肝[13-14]、保護(hù)腎臟[15-16]、提高心臟功能[17]等方面具有顯著效果。西紅花苷是西紅花的主要成分，在保護(hù)心臟、腎臟、肝臟[18-21]等方面有顯著作用。目前，對(duì)人參皂苷及西紅花苷的含量檢測(cè)研究較多[22-25]，但關(guān)于復(fù)方保健酒中人參皂苷及西紅花苷的檢測(cè)研究甚少。該研究將人參皂苷和西紅花苷作為復(fù)方保健酒的標(biāo)志性成分，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)復(fù)方保健酒中的標(biāo)志性成分人參皂苷、西紅花苷進(jìn)行檢測(cè)，為后期生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控及評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201933，含量：93.4%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-202028，含量：93.1%）、人參皂苷Rb2（批號(hào)：111715-201203，含量：93.8%）、西紅花苷I（批號(hào)：111588-201704，含量：88.4%）、西紅花苷II：（批號(hào)：111589-201705，含量：92.2%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rc（批號(hào)：CFS201901，含量：98%）：ChemFaces公司。

乙腈（HPLC級(jí)）：美國(guó)Fisher公司；水為超純水。

3批復(fù)方保健酒由勁牌有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀：美國(guó)賽默飛公司；SQP電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；SK1200H 數(shù)控超聲波清洗儀：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；RE-2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II對(duì)照品適量，加50%甲醇溶解，制成1 mL中含有人參皂苷Rg10.39 mg、人參皂苷Rb10.42 mg、人參皂苷Rb20.42 mg、人參皂苷Rc 0.41 mg、西紅花苷I 0.22 mg、西紅花苷II 0.24 mg的混合對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

精密量取人參保健酒樣品50 mL，置于茄形瓶中，于55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇溶解樣品，定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。

1.3.3 色譜條件

（1）人參皂苷含量檢測(cè)色譜條件

色譜柱：Agilent Sb-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫見(jiàn)表1；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 人參皂苷含量檢測(cè)梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for ginsenoside content detection

（2）西紅花苷含量檢測(cè)色譜條件

色譜柱：Agilent Sb-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫見(jiàn)表2；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表2 西紅花苷含量檢測(cè)梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for crocin content detection

1.3.4 人參皂苷及西紅花苷含量的測(cè)定

根據(jù)人參皂苷及西紅花苷對(duì)照品在色譜圖上的保留時(shí)間對(duì)復(fù)方保健酒的人參皂苷及西紅花苷進(jìn)行定性分析，同時(shí)以對(duì)照品濃度與樣品峰面積的比值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到各物質(zhì)的含量。計(jì)算公式如下：

式中：cx為樣品質(zhì)量濃度，mg/L；cr為對(duì)照品質(zhì)量濃度，mg/L；Ax為樣品峰面積，mAU·s；Ar為對(duì)照品峰面積，mAU·s。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用儀器自帶的軟件Chromeleon7用于查看色譜圖、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)考察

將“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋成5個(gè)不同濃度水平的對(duì)照品混合溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以物質(zhì)質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出線(xiàn)性關(guān)系及范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均＞0.999。

表3 各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程及線(xiàn)性關(guān)系Table 3 Standard curve regression equation and linear relationships of various constituents

2.1.2 人參皂苷和西紅花苷成分HPLC色譜圖

在“1.3.3”項(xiàng)色譜條件下將對(duì)照品及樣品進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1及圖2。結(jié)果顯示，對(duì)照品及樣品在相同時(shí)間下均有色譜峰出現(xiàn)，表明復(fù)方保健酒中含有人參皂苷及西紅花苷。

圖1 人參皂苷成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ginsenoside components

圖2 西紅花苷成分HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of crocin composition

將樣品于190～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，西紅花苷I、西紅花苷II在波長(zhǎng)440 nm處有較大的的吸收峰，因此將440 nm作為西紅花苷成分的檢測(cè)波長(zhǎng)；而人參皂苷在波長(zhǎng)190～210 nm區(qū)間范圍內(nèi)有較大的響應(yīng)，但隨著波長(zhǎng)的增大，響應(yīng)值逐漸減小，因此對(duì)人參皂苷成分進(jìn)行不同波長(zhǎng)下（190 nm、230 nm）進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 不同波長(zhǎng)條件下西紅花苷及人參皂苷掃描圖譜Fig.3 Scanning profile of crocin and ginsenoside under different wavelength conditions

圖4 不同波長(zhǎng)下人參皂苷色譜圖Fig.4 Chromatograms of ginsenosides at different wavelengths

由圖4可知，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為190 nm時(shí)色譜峰的基線(xiàn)不平，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm時(shí)，基線(xiàn)平穩(wěn)，故選擇203 nm作為人參皂苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

取同一酒樣，按照1.3.2供試品溶液制備方法制備供試品，人參皂苷按1.3.3項(xiàng)下人參皂苷含量檢測(cè)色譜條件進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積；西紅花苷按“1.3.3”項(xiàng)下西紅花苷含量檢測(cè)色譜條件進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.85%、0.74%、1.22%、0.66%、0.43%、0.73%，均＜5%，表明該儀器精密度良好。

表4 各成分含量的精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 4 Precision test results of each component

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一酒樣，人參皂苷檢測(cè)按“1.3.3”項(xiàng)下人參皂苷含量檢測(cè)色譜條件分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、18 h進(jìn)樣，記錄峰面積，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5；西紅花苷檢測(cè)按“1.3.3”項(xiàng)下西紅花苷含量檢測(cè)色譜條件分別于0 h、3 h、5 h、8 h、12 h、16 h進(jìn)樣，記錄峰面積，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。由表5表6可知，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II峰面積測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為0.86%、1.11%、1.47%、1.26%、1.05%、1.12%，表明供試品溶液中人參皂苷在室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，西紅花苷在室溫條件下16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 人參皂苷各成分的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Stability test results of each component of ginsenoside

表6 西紅花苷各成分的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Stability test results of each component of crocin

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一酒樣，按照“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品6份，分別按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，記錄含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II峰面積測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為1.73%、0.75%、1.12%、0.67%、0.36%、0.23%，均＜5%，表明該方法重復(fù)性良好。

表7 各成分重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 7 Repeatability test results of each component

2.1.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一酒樣25 mL至茄形瓶中，共9份，分別按照酒樣中各成分含量的低、中、高三個(gè)水平加入對(duì)照品適量，分別按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，各成分平均加標(biāo)回收率分別為人參皂苷Rg199.15%、人參皂苷Rb1101.72%、人參皂苷Rb2100.64%、人參皂苷Rc 100.52%、西紅花苷I 99.36%、西紅花苷II 97.83%。加標(biāo)回收率的RSD值分別為3.15%、1.75%、2.83%、3.42%、2.98%、3.37%，均＜5%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表8 樣品中各成分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Recovery rates tests results of each component in the samples

2.2 樣品含量測(cè)定

取3批次復(fù)方保健酒樣品，按照“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，分別按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，計(jì)算各批次復(fù)方保健酒樣品中各成分的含量，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，3批次的復(fù)方保健酒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II含量的RSD值均＜2%，表明復(fù)方保健酒的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定。

表9 樣品中人參皂苷和西紅花苷含量的測(cè)定結(jié)果Table 9 Determination results of ginsenoside and crocin contents of samples

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC法測(cè)定復(fù)方保健酒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II的含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可為后期復(fù)方保健酒生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控及評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。