氣相色譜-內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯含量

畢榮宇，喬敏莎，盧 君*，唐 平，山其木格，王 麗，王 凡，李長(zhǎng)文

（1.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410）

中國(guó)白酒作為世界六大蒸餾酒之一，歷史悠久，風(fēng)格獨(dú)特[1-2]。其主要成分除占98%的乙醇和水外，還含有2%的醇、酸、酯、醛和其他芳香族化合物等微量成分[3-6]。其中含量較高的棕櫚酸乙酯（ethyl palmitate，EP）、油酸乙酯（ethyl oleate，EO）和亞油酸乙酯（ethyl linoleate，EL）并稱(chēng)為白酒中的三大高級(jí)脂肪酸乙酯[7]。這3種高級(jí)脂肪酸乙酯不溶于水，溶于乙醇，沸點(diǎn)高，不易揮發(fā)[8-10]。3種高級(jí)脂肪酸乙酯是白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，它們可以增加酒的厚重感，減少干澀，增強(qiáng)后味[11]。這些物質(zhì)在酒體中的穩(wěn)定性與酒精度、在酒精中的溶解度以及環(huán)境溫度密切相關(guān)，相關(guān)研究表明，3種高級(jí)脂肪酸乙酯的含量在低度酒中超過(guò)2 mg/L時(shí)，就會(huì)造成白酒酒體渾濁，影響白酒質(zhì)量[12-13]。因此，很多酒類(lèi)企業(yè)為了保障產(chǎn)品的透明度，會(huì)嚴(yán)格控制其含量或者在工藝環(huán)節(jié)直接去除。白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯的準(zhǔn)確定量是監(jiān)管與控制的前提。

目前，3種高級(jí)脂肪酸乙酯的檢測(cè)方法在相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中都未涉及，文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[14-16]和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法。劉奕霏等[7]建立了白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該方法可成為白酒真?zhèn)舞b定和案件串并溯源工作的一項(xiàng)重要技術(shù)手段。左國(guó)營(yíng)等[8]利用GC-MS對(duì)白酒中油狀物質(zhì)進(jìn)行了定性分析，通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，樣品中的己酸乙酯、棕櫚酸乙酯和亞油酸乙酯含量相對(duì)較大，是造成白酒降度渾濁的主要因素。徐軍[17]對(duì)濃香型枝江白酒香味成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明，摘酒度數(shù)越低，蒸餾過(guò)程中后段酒高級(jí)脂肪酸乙酯含量越高。李凱敏[18]采用優(yōu)化后的頂空固相微萃取條件（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）對(duì)特香型原酒樣品進(jìn)行萃取，進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果表明，特香型白酒風(fēng)味成分中響應(yīng)值較高的峰均為棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯等乙酯類(lèi)物質(zhì)，證明了酯香是特香型白酒的主體風(fēng)味。NIU Y W等[19]采用氣相色譜-嗅覺(jué)測(cè)量法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和GC-MS對(duì)中國(guó)茅臺(tái)酒中的31種酯類(lèi)香氣成分進(jìn)行了鑒定，采用液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和HS-SPME兩種方法提取后，采用GC-MS對(duì)其進(jìn)行了定量分析，其中棕櫚酸乙酯的含量在11.888 0～12.009 0 mg/L之間。MA L H等[20]利用HS-SPME和同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）結(jié)合GC-MS和GC-O對(duì)致中和五加皮藥酒中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，其中棕櫚酸乙酯的含量為0.806 1 mg/L。WANG J S等[21]利用現(xiàn)代分離技術(shù)和分子感官評(píng)價(jià)方法揭示了濃香型白酒中的香氣化合物，詳細(xì)介紹了棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等46種酯類(lèi)化合物的研究進(jìn)展。

本研究以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)物，建立了白酒中棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯的氣相色譜（GC）檢測(cè)方法，并探究了市售不同香型白酒、不同品牌醬香型白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯的含量分布規(guī)律，為定性、定量分析白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯提供準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)方法。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與試劑

不同香型白酒酒樣（共11種）（編號(hào)為醬香型7-2#、濃香型8-5#、清香型7-1#、老白干香型7-3#、芝麻香型8-6#、豉香型7-4#、鳳香型8-1#、兼香型8-3#、米香型7-5#、董香型8-2#、馥郁香型8-4#；不同品牌醬香型白酒酒樣（共35種）（編號(hào)為JT9-1#～JT9-5#、LT12-1#～LT12-5#、GT10-1#～GT10-5#、DT13-1#～DT13-5#、XT14-1#～XT14-5#、MT15-1#～MT15-5#、ZT17-1#～ZT17-5#）：市售。

棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯（純度均＞97%）、乙醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；乙酸正戊酯（純度99.5%）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo trace 1310氣相色譜（GC）儀（配備AI-1310自動(dòng)進(jìn)樣器）、Gen Pure xCAD Plus純水機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；ME204T電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent HP-FFAP色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

3種高級(jí)脂肪酸乙酯和乙酸正戊酯儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯140.1 mg、133.6 mg、144.8 mg，用體積分?jǐn)?shù)53%乙醇溶液定容至20 mL；乙酸正戊酯稱(chēng)取1.762 9 g，用體積分?jǐn)?shù)53%乙醇溶液定容100 mL。棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯的質(zhì)量濃度分別為6.935 0 mg/mL，6.546 4 mg/mL，7.002 8 mg/mL；乙酸正戊酯的質(zhì)量濃度為0.175 4 mg/mL。

3種高級(jí)脂肪酸乙酯中間液：分別準(zhǔn)確移取3種高級(jí)脂肪酸乙酯儲(chǔ)備液5 mL至50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)53%乙醇溶液定容。棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯的質(zhì)量濃度分別為0.693 5 mg/mL、0.654 6 mg/mL、0.702 3 mg/mL。

3種高級(jí)脂肪酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取不同體積的中間液（0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、1.00 mL、4.00mL、6.00 mL），用體積分?jǐn)?shù)53%乙醇溶液定容至10 mL，質(zhì)量濃度分別為0.0030mg/mL、0.0070mg/mL、0.017 0mg/mL、0.070 0 mg/mL、0.2700mg/mL、0.3900mg/mL。

1.3.2 樣品前處理

取酒樣混勻后放置磨口玻璃瓶?jī)?nèi)待用。準(zhǔn)確量取酒樣5.00 mL于10 mL具塞磨口離心管中，加入內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，混勻，供GC分析。

1.3.3 儀器檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-FFAP色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；分流進(jìn)樣，分流比1∶25；分流流量為75.0 mL/min；吹掃流量2.0 mL/min；橫流模式；流速為3 mL/min；程序升溫為初始柱溫37 ℃，保持7 min，以3.5 ℃/min升溫至45.0 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至80 ℃，保持0 min；再以10 ℃/min升溫至100 ℃，保持4 min；再以20 ℃/min升溫至180 ℃，保持0 min；再以15 ℃/min升溫至200 ℃，保持20 min；載氣為氮?dú)猓∟2）；檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）；檢測(cè)器溫度為250 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定

取一定濃度的3種高級(jí)脂肪酸乙酯混合溶液進(jìn)行氣相色譜分析，通過(guò)每種高級(jí)脂肪酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)樣品確定其保留時(shí)間結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，3種高級(jí)脂肪酸乙酯均可以檢出，乙酸正戊酯（內(nèi)標(biāo)）、棕櫚酸乙酯（EP）、油酸乙酯（EO）和亞油酸乙酯（EL）的保留時(shí)間分別為18.287 min、34.957 min、39.853 min、41.438 min，各物質(zhì)色譜峰可以達(dá)到完全分離（R＞1.5），能實(shí)現(xiàn)良好的分離。

圖1 3種高級(jí)脂肪酸乙酯與乙酸正戊酯的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 3 kinds of higher fatty acid ester and n-amyl acetate standard

2.2 方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限

準(zhǔn)確量取100 μL乙酸正戊酯內(nèi)標(biāo)溶液加入不同質(zhì)量濃度的3種高級(jí)脂肪酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液中，混合均勻。以3種高級(jí)脂肪酸乙酯質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，3種高級(jí)脂肪酸乙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯峰面積比（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用0.003 0 mg/mL的質(zhì)量濃度水平為依據(jù)，3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ），得到3種高級(jí)脂肪酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，3種高級(jí)脂肪酸乙酯在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均≥0.999 2。棕櫚酸乙酯（EP）、油酸乙酯（EO）、亞油酸乙酯（EL）的檢出限分別為0.003 4 mg/mL、0.003 2 mg/mL、0.003 5 mg/mL，定量限分別為0.011 6 mg/mL、0.010 9 mg/mL、0.011 7 mg/mL，本方法具有較低的檢出限與定量限，靈敏度能夠滿(mǎn)足白酒中高級(jí)脂肪酸乙酯的檢測(cè)需求。

表1 3種高級(jí)脂肪酸乙酯的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 3 kinds of higher fatty acid esters

2.3 加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取10 mL的酒樣，分別按照低、中、高三個(gè)水平添加高級(jí)脂肪酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理方法進(jìn)行處理并測(cè)定高級(jí)脂肪酸乙酯的含量，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算高級(jí)脂肪酸乙酯的平均加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種高級(jí)脂肪酸乙酯加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of standard recovery rate and precision tests of 3 kinds of higher fatty acid esters

由表2可知，3種高級(jí)脂肪酸乙酯的平均加標(biāo)回收率為90.10%～116.97%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD為2.19%～4.65%，表明該方法回收率高，準(zhǔn)確度良好，符合白酒中棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯的分析檢測(cè)要求。

2.4 白酒樣品的高級(jí)脂肪酸乙酯檢測(cè)

2.4.1 不同香型白酒樣品的高級(jí)脂肪酸乙酯檢測(cè)

酯類(lèi)物質(zhì)是白酒香味的重要組成部分，3種高級(jí)脂肪酸乙酯不僅在白酒的呈香過(guò)程也起著助香和呈味的作用，在酒體內(nèi)以不同的強(qiáng)度釋放香氣，有助于形成白酒的復(fù)合香氣，形成獨(dú)特風(fēng)格的特點(diǎn)，而且是評(píng)價(jià)白酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的最直觀的指標(biāo)之一[22-23]。利用實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法，對(duì)不同香型白酒中高級(jí)脂肪酸乙酯含量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同香型白酒高級(jí)脂肪酸乙酯含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of higher fatty acid ethyl esters contents of different flavor Baijiu mg/mL

由表3可知，11種不同香型白酒樣品中，除豉香型白酒未檢測(cè)出3種高級(jí)脂肪酸乙酯外，其余10種香型白酒均檢測(cè)出3種高級(jí)脂肪酸乙酯。其中棕櫚酸乙酯含量最高的是醬香型白酒，含量為0.029 2 mg/mL，油酸乙酯含量最高的是老白干香型，含量為0.012 6 mg/mL，亞油酸乙酯含量最高的是醬香型白酒，含量為0.020 5 mg/mL。綜合對(duì)比3種高級(jí)脂肪酸乙酯總量，總含量最高的白酒是醬香型白酒，含量為0.062 2 mg/mL，其次是老白干香型和鳳香型白酒，含量分別為0.053 9 mg/mL和0.050 9 mg/mL。高級(jí)脂肪酸乙酯屬于高沸點(diǎn)物質(zhì)，醬香型白酒獨(dú)特的“四高”生產(chǎn)工藝及原料中氮元素含量高可能是其高級(jí)脂肪酸乙酯含量較高的原因之一，而豉香型白酒含量較低也可能與其原料中有機(jī)氮源和脂肪含量較少有關(guān)[10，24-25]。

2.4.2 不同品牌醬香型白酒樣品的高級(jí)脂肪酸乙酯檢測(cè)

在研究的基礎(chǔ)上，醬香型白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯的含量較高。因此實(shí)驗(yàn)選取了市售不同醬香型品牌共計(jì)35種醬香型白酒進(jìn)行3種高級(jí)脂肪酸乙酯含量的對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同品牌醬香型白酒中高級(jí)脂肪酸乙酯含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of higher fatty acid ethyl esters content in different brands of sauce-flavor Baijiu mg/mL

由表4可知，醬香型白酒的3種高級(jí)脂肪酸乙酯的總含量在0.003 5～0.075 8 mg/mL之間。其中MT15-1白酒樣品中只檢測(cè)到了亞油酸乙酯，其余醬香型白酒樣品均檢測(cè)到3種高級(jí)脂肪酸乙酯。XT品牌醬香型白酒中所含3種高級(jí)脂肪酸乙酯的含量均明顯低于其他品牌醬香型白酒，這也可能是XT品牌醬香型白酒口味較寡淡的原因之一。檢測(cè)結(jié)果表明，3種高級(jí)脂肪酸乙酯在醬香型白酒中普遍存在，特別是溫度降低后會(huì)出現(xiàn)絮狀渾濁[26-27]，因此，白酒企業(yè)還是要不斷的提高3種高級(jí)脂肪酸乙酯的監(jiān)測(cè)能力，控制其含量，避免出現(xiàn)渾濁，影響白酒的質(zhì)量。

3 結(jié)論

白酒酒尾水油狀物的主要成分為高級(jí)脂肪酸乙酯，通過(guò)其含量的控制也可以實(shí)現(xiàn)酒尾的再利用，制成高酸高酯的調(diào)味酒，為企業(yè)增加效益。因此，對(duì)其準(zhǔn)確定量顯得尤其重要。采用氣相色譜（GC）結(jié)合內(nèi)標(biāo)法，建立了3種高級(jí)脂肪酸乙酯的檢測(cè)方法，并對(duì)11種不同香型白酒及不同品牌醬香型白酒中高級(jí)脂肪酸乙酯的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，該方法能使3種高級(jí)脂肪酸乙酯得到很好的分離，3種高級(jí)脂肪酸乙酯在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性范圍為0.003 0～0.400 0 mg/mL，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.999，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5%，平均加標(biāo)回收率為94.01～116.97%，檢出限為0.003 2～0.003 5 mg/mL，定量限為0.010 9～0.011 7 mg/L。對(duì)市售11種不同香型白酒中的3種高級(jí)脂肪酸乙酯含量進(jìn)行測(cè)定，除豉香型白酒未檢測(cè)出3種高級(jí)脂肪酸乙酯外，其余10種香型白酒均能檢出，其中，醬香型白酒含量最高。同時(shí)對(duì)市售35種不同品牌醬香型白酒中的3種高級(jí)脂肪酸乙酯含量進(jìn)行測(cè)定，其總含量在0.003 5～0.075 8 mg/mL之間。該方法準(zhǔn)確、靈敏度高，能對(duì)白酒中3種高級(jí)脂肪酸乙酯進(jìn)行有效分析，可用于酒類(lèi)企業(yè)日常白酒分析工作，通過(guò)控制其含量，避免酒體出現(xiàn)渾濁，影響白酒的質(zhì)量。