QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS法測定番茄中19種農(nóng)藥殘留

田金鳳

（攀枝花學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，四川 攀枝花 617000）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）又稱西紅柿，茄科番茄屬，營養(yǎng)豐富[1-2]。米易縣是國家級南菜北運基地，冬季氣溫高，光熱和水資源豐富，適宜種植早春蔬菜，而番茄（品種以石頭番茄、以色列系列為主）作為該地區(qū)種植面積最大的早春蔬菜生產(chǎn)品種，在大棚種植的番茄每畝產(chǎn)10 000～15 000 kg[3-4]。隨著番茄種植規(guī)模的不斷擴大以及長期連作、錯季種植和大水大肥栽培等因素，易在番茄生長過程中發(fā)生病蟲害，但部分生產(chǎn)者不按規(guī)定農(nóng)藥劑量或安全間隔期濫用，或者為提高果蔬產(chǎn)量和品質(zhì)使用農(nóng)藥，均可能造成番茄的農(nóng)藥殘留超標，帶來環(huán)境和食品安全問題[5]。

現(xiàn)在中國是世界上番茄種植面積最大，產(chǎn)量最多的國家[2]。國標GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定番茄專屬的農(nóng)藥最大殘留限量（maximum residue limits，MRL）137種，主要含除草劑8種、殺蟲劑36種、植物生長調(diào)節(jié)劑6種、殺菌劑74種、殺螨劑9種、殺線蟲劑2種、殺螺劑1種、增效劑1種[6]，比GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的番茄專屬農(nóng)藥MRL（118種）多19種；同時，對接歐盟規(guī)定的番茄農(nóng)藥MRL（485 種）標準，降低番茄出口貿(mào)易風險[2，7]，科學指導番茄的病蟲害防治和合理的使用農(nóng)藥，采用簡單、快速、高靈敏的檢測是農(nóng)殘品控的前提手段，滿足番茄內(nèi)需和出口的要求。

目前，GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定》中蔬菜農(nóng)藥殘留量檢測方法的前處理操作復(fù)雜、費用高，不適用分析大批量樣品的快速定性及定量檢測[8]。而QuEChERS技術(shù)具有快速、高效等優(yōu)點[9]，且針對米易番茄的糖分和色素類等基質(zhì)成分多而復(fù)雜，分離分析難度大，檢測雜質(zhì)干擾嚴重，本實驗優(yōu)化了QuEChERS前處理條件，提高了方法的適用性。同時，檢測番茄中農(nóng)藥殘留的方法眾多，常見的有超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[10-12]、高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用[13-16]和氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用[17-19]等，但尚未見同時檢測番茄中10種殺菌劑（甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉、咪鮮胺、三唑酮、丙環(huán)唑、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈）和9種殺蟲劑（氧樂果、克百威、三羥基克百威、滅多威、腐霉利、異丙威、吡蟲啉、啶蟲脒和氯蟲苯甲酰胺）殘留量的高靈敏測定方法。為了促進食品安全及國標中番茄專屬的農(nóng)殘檢測的數(shù)量增加和低限量要求，本實驗在前人的研究基礎(chǔ)上，以攀枝花米易縣的番茄為研究對象，采用QuEChERS凈化-UPLC-MS/MS法測定番茄中甲霜靈等19種殺蟲劑和殺菌劑殘留，其方法的靈敏度高，操作相對簡易，符合番茄中農(nóng)藥殘留快速批量檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

番茄：米易地區(qū)市售或采摘。

1.1.2 試劑

10種殺菌劑（烯酰嗎啉、咪鮮胺、三唑酮、多菌靈、甲霜靈、嘧霉胺、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、戊唑醇），9種殺蟲劑（氧樂果、克百威、三羥基克百威、滅多威、異丙威、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、氯蟲苯甲酰胺）標準品（純度均＞98%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲酸、甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6460A型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）儀：美國Agilent 公司；1-14k高速離心機：美國Sigma公司；Vortex 4渦旋混合器：比利時LMS公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

取適量19種（10種殺菌劑+9種殺蟲劑）標準品，分別用4 mmol/L甲酸水-甲醇溶液[20]配制成5.0 mg/mL的標準農(nóng)藥溶液；其他濃度標液按照實驗需求定量稀釋即得，-20 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取10.0 g番茄（去柄，經(jīng)組織攪碎機粉碎）樣品（精確至0.01 g）于25 mL離心管中，加入10 mL 0.5%甲酸乙腈溶液[21]，振蕩渦旋15 min，加入無水硫酸鎂5 g和氯化鈉1 g[22-24]，立即渦旋混勻10 s，然后12 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL，轉(zhuǎn)移至QuEChERS試劑管（含MgSO4、N-丙基乙二胺（primarysecondaryamine，PSA）、C18、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB））中渦旋混勻60 s，在15 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，即得。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：Aglient-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相4 mmol/L甲酸水-甲醇；流速0.2 mL/min；進樣體積2 μL；柱溫30 ℃；洗脫方式為梯度洗脫，洗脫程序：0～7.5 min，甲醇體積分數(shù)為30%→90%；7.5～10 min，甲醇體積分數(shù)為90%；10～10.5 min，甲醇體積分數(shù)90%→30%；10.5～15 min，甲醇體積分數(shù)30%vol。

質(zhì)譜條件（參數(shù)見表1）：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方式采集[25]。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下19種標品的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of 19 pesticide residues under multiplereaction monitoring mode

1.3.4 方法的標準曲線及檢出限、定量限

利用空白番茄基質(zhì)提取液將500 μg/L混合標準溶液依次稀釋成質(zhì)量濃度為200 μg/L、160 μg/L、100 μg/L、80 μg/L、50 μg/L、20 μg/L、10 μg/L、5 μg/L、2 μg/L的溶液，分別進行測定，用外標法建立標準曲線。以3倍信噪比（S/N＞3）和10倍信噪比（S/N＞10）分別確定方法檢出限（limit of detection，LOD）與方法定量限（limit of quantitation，LOQ）[26]。

1.3.5 方法的精密度和加標回收率試驗

取番茄樣品10.0 g，于番茄基質(zhì)中添加標準液（10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg）3個水平下，搖勻、靜置后按“1.3.2”樣品前處理后，其樣品溶液再按“1.3.3”儀器條件進樣（6次平行試驗），測加標回收率和精密度。根據(jù)測定的峰面積計算其質(zhì)量濃度，并計算分析結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)為6次重復(fù)實驗的平均值，采用Microsoft Excel 2007軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過Origin7.5軟件進行制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

實驗中，以80 μg/kg 的混合標液進樣，篩選Aglient-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Poroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），優(yōu)化其儀器條件，結(jié)果表明用Aglient-C18柱適用性好，峰形尖銳對稱，分離度較好；而流動相中加入少量酸能夠達到改善峰形，并使化合物易離子化，提高靈敏度[25]。19種農(nóng)藥的MRM總離子流色譜圖和定量離子色譜圖見圖1、圖2。

圖1 19種農(nóng)藥混合標準溶液總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatography of 19 pesticide mixed standard solutions

圖2 19種農(nóng)藥定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatograms of the 19 pesticides

2.2 提取條件優(yōu)化

由于米易地區(qū)的番茄糖分和色素類等基質(zhì)成分多而復(fù)雜，因而在樣品前處理過程中，參照文獻[21，25]的方法，采用不同體積（5 mL、10 mL、15 mL）0.5%甲酸乙腈溶液，分別進行提取比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧樂果等殺蟲劑和殺菌劑經(jīng)10 mL 0.5%甲酸乙腈溶液萃取1次效果好。同時，樣品前處理過程中用QuEChERS，其中MgSO4去除樣品中過量的水，PSA主要去除番茄中的糖類和花青素類色素，C18主要去除非極性干擾物，GCB去除樣品中的色素等。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

番茄樣品中存在大量生物活性物質(zhì)，可能影響19種農(nóng)藥離子強度從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects，ME）[27]，對檢測結(jié)果存在影響。參照文獻中的計算公式和方法[28]，如表2所示，番茄基質(zhì)的|ME-1|≤20%，說明樣品經(jīng)萃取和QuEChERS法讓樣品基質(zhì)凈化效果較好，本實驗則可忽略弱基質(zhì)效應(yīng)。

表2 19種農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear range,regression equations,correlation coefficients,limits of detection,and limits of quantification of 19 pesticides

2.4 方法的線性關(guān)系及檢出限

在2.0～200.0 μg/L線性范圍內(nèi)，氧樂果等19種殺蟲劑和殺菌劑（農(nóng)藥）的相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.998，定量限為0.15～1.50 μg/kg（見表2），均低于GB 2763—2021食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量中“番茄”或“茄果類水果”相應(yīng)農(nóng)藥規(guī)定的最大殘留限量值[6]。從定量限（樣品中被測物能被定量測定的最低量）方面，表明該分析方法具備了更好的靈敏性。

2.5 方法的回收率與精密度

分別以10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg的水平將氧樂果等農(nóng)藥添加到空白番茄基質(zhì)中，測定方法的加標回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，19種殺蟲劑和殺菌劑（農(nóng)藥）在番茄中的加標回收率范圍為79.8%～103.9%，RSD為3.2%～11.8%，滿足農(nóng)藥定量分析要求[29]。

表3 方法的回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of method (n=6)

2.6 實際樣品分析

按選定的試驗方法下，對市售的番茄共20份樣品進行分析，樣品中19種農(nóng)藥的殘留量均低于檢測限，未檢出。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合QuEChERS萃取凈化技術(shù)，以UPLC-MS/MS法建立了攀枝花米易縣的番茄中19種農(nóng)藥殘留的分析檢測方法。實驗的前處理方法（樣品采用0.5%甲酸-乙腈提取，石墨化碳黑胺基的QuEChERS試劑管凈化）操作簡便，靈敏度高，干擾少，其定量限范圍在0.15～1.50 μg/kg，均低于GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中“番茄”或“茄果類水果”相應(yīng)農(nóng)藥規(guī)定的最大殘留限量值，且樣品中19種農(nóng)藥均未檢出，方法適合于番茄的日常農(nóng)藥殘留檢測。