冷沉淀質(zhì)量抽檢：凝血因子Ⅷ活性測(cè)定的影響因素

房云海（Fang Yunhai），張心聲（Zhang Xinsheng）

（山東省血液中心山東省血友病診療中心，濟(jì)南，250014；

冷沉淀在1964 年由美國(guó)醫(yī)生Judith Graham Pool 首先發(fā)現(xiàn)，是采用特定的方法將新鮮冰凍血漿在1～6 ℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的冷不溶解物質(zhì)速凍的成分血［1］。 冷沉淀的質(zhì)量抽檢需要進(jìn)行凝血因子Ⅷ（FⅧ）活性測(cè)定，但對(duì)于如何測(cè)定冷沉淀中FⅧ的活性，尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。血站技術(shù)操作規(guī)程（2019 版）和全血及成分血質(zhì)量監(jiān)測(cè)指南（WS／T550-2017）要求在使用血凝儀測(cè)定時(shí)，應(yīng)參照廠家使用說(shuō)明［2-3］。 血凝儀廠家的使用說(shuō)明往往是針對(duì)患者血漿FⅧ活性測(cè)定，而不是針對(duì)冷沉淀，冷沉淀中的FⅧ活性遠(yuǎn)高于日常檢測(cè)的患者血漿，也遠(yuǎn)超標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)范圍，在測(cè)定過(guò)程中很多細(xì)節(jié)會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。 我們根據(jù)日常工作經(jīng)驗(yàn)和復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，對(duì)冷沉淀FⅧ活性測(cè)定全過(guò)程中需要注意的問(wèn)題總結(jié)如下。

1 冷沉淀抽樣的控制

目前血站技術(shù)操作規(guī)程（2019 版）要求成分血質(zhì)量檢查的抽樣量為每月制備量的1%或至少4袋。 若該成分血每月制備量少于4 袋的，由血站根據(jù)統(tǒng)計(jì)過(guò)程抽樣原則自行制定抽樣頻次［2］。 由于不同血型的獻(xiàn)血者本身FⅧ的水平也有差異，冷沉淀的凝血因子質(zhì)控抽樣時(shí)要注意血型的影響，如果抽檢4 袋冷沉淀的話，建議每個(gè)血型一袋，如果抽檢袋數(shù)超過(guò)4 袋，建議按照制備量選擇血型抽檢。 O型血的人FⅧ和血管性血友病因子（VWF）整體偏低，所以O(shè) 型血漿和冷沉淀的FⅧ和VWF 含量也整體偏低。

1979 年7 月柳葉刀雜志發(fā)表的文章研究了冷沉淀中FⅧ含量和血型的關(guān)系［4］，這些冷沉淀均來(lái)源于一個(gè)單位全血（約513 mL）分離后的血漿（約225 mL），其中O 型冷沉淀FⅧ含量要低于其他血型，而Rh 陰性或陽(yáng)性則對(duì)凝血因子水平影響不大（表1）。 我們?cè)?012 年檢測(cè)了40 袋冷沉淀中FⅧ含量，這些冷沉淀均來(lái)源于400 mL 的全血，其中O型冷沉淀中FⅧ含量最低，AB 型冷沉淀中FⅧ含量最高（表2）［5］，跟柳葉刀雜志的結(jié)果相符。 不符合要求的11 袋冷沉淀中，有7 袋是O 型的冷沉淀，而這些O 型冷沉淀本身的原料血漿中FⅧ就整體偏低。 目前尚不能常規(guī)開(kāi)展制備前的凝血因子檢測(cè)，所以我們?cè)谂R床使用O 型冷沉淀治療時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)調(diào)整用量。

表2 我中心檢測(cè)40 袋冷沉淀原料血漿及冷沉淀中FⅧ含量

2 冷沉淀融化條件的控制

冷沉淀應(yīng)該在37 ℃水浴中快速充分融化，一般需要融化15～20 min。 室溫融化或融化時(shí)間太短會(huì)形成冷沉淀，影響FⅧ的檢測(cè)；融化時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)增加FⅧ的損耗。

血站技術(shù)操作規(guī)程（2019 版）里面冷沉淀的制備方法有兩種，分別是離心法和虹吸法，最后的體積都是40 ～50 mL。 冷沉淀的體積增加以后，充分融化需要的時(shí)間也隨之增加。

英國(guó)最新的出凝血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南指出，如果血漿不能及時(shí)檢測(cè)，凍存后融化的要求是在37 ℃融化5 分鐘或直至充分融化，目的是避免形成冷沉淀，影響檢測(cè)結(jié)果［6］。 融化5 min 的檢測(cè)用血樣一般只有1 mL 左右，冷沉淀體積是40～50 mL，如果融化5 min，顯然不能充分融化。 英國(guó)的一項(xiàng)針對(duì)冷沉淀質(zhì)控的研究中把冷沉淀在35±2 ℃融化20 min，冷沉淀的FⅧ含量是符合要求的，所以冷沉淀融化時(shí)間不超過(guò)20 min，對(duì)于FⅧ的含量影響不大［7］。

3 冷沉淀融化后取樣和樣品檢測(cè)前的保存條件

冷沉淀融化后，取樣檢測(cè)前需要充分混勻，混勻后的樣本更能代表整個(gè)冷沉淀的質(zhì)量。 混勻時(shí)應(yīng)避免劇烈振蕩和產(chǎn)生氣泡。 冷沉淀融化后放在室溫，盡快上機(jī)檢測(cè)，最長(zhǎng)不要超過(guò)4 個(gè)小時(shí)。 2021 年發(fā)布的凝血因子活性測(cè)定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中，要求在4 h 內(nèi)完成血漿標(biāo)本檢測(cè)［8］。 再有要避免檢測(cè)血樣的反復(fù)凍融，血樣一旦融化后，除非檢測(cè)都完成，不要再次凍存。

冷沉淀融化后儲(chǔ)存的溫度條件，不同的文獻(xiàn)上有三種選擇，分別是放到冰水混合物上、2 ～4 ℃冷藏和室溫保存。 放置到冰水混合物上，只是在室溫高于25 ℃時(shí)需要這樣操作，目前大部分的實(shí)驗(yàn)室都不會(huì)超溫，所以一般不推薦這個(gè)選擇。 而且冰水混合物溫度太低，可能激活凝血因子Ⅶ，影響最終檢測(cè)結(jié)果。

2016 年，英國(guó)的研究人員把冷沉淀融化后，在室溫（22 ～24 ℃）放置，然后在融化后0、4、10、24、48、72 h 的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)。 與融化后0 h 相比，從24 h開(kāi)始，F(xiàn)Ⅷ降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但降低的不到10%。在0 到48 h，有94%的冷沉淀檢測(cè)FⅧ水平符合英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)的要求，在72 h 的點(diǎn)，88%的冷沉淀檢測(cè)FⅧ水平合格，都高于英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)要求的75%以上的抽檢樣本合格。 該項(xiàng)研究顯示，在室溫條件下FⅧ的活性比我們預(yù)期的要更穩(wěn)定［7］。

4 冷沉淀FⅧ活性測(cè)定樣品的預(yù)稀釋

質(zhì)量合格的冷沉淀中F Ⅷ活性一般在200 ～1000 IU／dL，遠(yuǎn)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，為保證檢測(cè)的結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，在檢測(cè)FⅧ的時(shí)候必須進(jìn)行預(yù)稀釋?zhuān)话阆♂? 倍或者10 倍。 具體稀釋倍數(shù)應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況進(jìn)行驗(yàn)證。 世界血友病聯(lián)盟實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中稀釋液包括凝血因子檢測(cè)中的緩沖液或乏凝血因子Ⅷ，但首選的是乏凝血因子Ⅷ［9］。我們實(shí)驗(yàn)室冷沉淀一般稀釋5 倍后進(jìn)行檢測(cè)，稀釋液采用全自動(dòng)血凝儀配套的緩沖液。

5 FⅧ活性測(cè)定結(jié)果的表達(dá)方式

在進(jìn)行FⅧ活性檢測(cè)時(shí)，常用的單位有三個(gè)，分別是%，IU／dL（單位／分升）和IU／mL（單位／毫升）。

我們假定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的正常人，他的凝血因子水平也是最標(biāo)準(zhǔn)的，就是1 mL 血漿里面有1 個(gè)單位的凝血因子，他的凝血因子水平就是1 IU／mL，也就是100%。

換算成IU／dL 單位，對(duì)于他來(lái)說(shuō)每分升血漿是100 mL，每毫升里面1 個(gè)單位的凝血因子，每分升里面是100 個(gè)單位的凝血因子，所以他的凝血因子水平是100 IU／dL。 這個(gè)人的凝血因子水平用不同的單位表示為：100%＝100 IU／dL＝1 IU／mL。

血友病診斷與治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)中凝血因子檢測(cè)的單位用的是IU／dL［10］，而我們國(guó)內(nèi)檢測(cè)報(bào)告上最常用的還是%這個(gè)單位。 但在冷沉淀質(zhì)控中，計(jì)算結(jié)果時(shí)需要把凝血因子的單位換算到IU／mL。

6 冷沉淀FⅧ含量的計(jì)算

冷沉淀質(zhì)控的要求是每袋冷沉淀的FⅧ含量，需要用冷沉淀的FⅧ活性水平乘上體積。 不同的全自動(dòng)血凝儀，檢測(cè)結(jié)果的單位可能有差別，但是最后計(jì)算FⅧ含量的時(shí)候，需要把凝血因子的單位換算到IU／mL，然后乘上冷沉淀的毫升數(shù)，就得到了每袋冷沉淀含F(xiàn)Ⅷ的單位數(shù)。 《全血和成分血質(zhì)量要求》中冷沉淀質(zhì)量控制項(xiàng)目要求來(lái)源于400 mL 全血的冷沉淀中FⅧ≥80 IU，來(lái)源于300 mL 全血的FⅧ≥60 IU，來(lái)源于200 mL 全血的FⅧ≥40 IU。

7 冷沉淀FⅧ含量質(zhì)量抽檢結(jié)果的解釋和利用

由于獻(xiàn)血者本身FⅧ含量的差異，75%以上的冷沉淀抽檢合格即為符合血液質(zhì)量要求。 如果抽檢4 袋冷沉淀，低于75%的冷沉淀符合質(zhì)量要求，可以考慮增加抽樣數(shù)量，增加抽樣數(shù)量后仍然不合格，那就要針對(duì)冷沉淀制備的整個(gè)過(guò)程查找原因，加強(qiáng)冷沉淀制備全過(guò)程的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化操作。

8 FⅧ活性測(cè)定試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、使用與更新

標(biāo)準(zhǔn)曲線不是一成不變的，在試劑批號(hào)更換的時(shí)候需要重新定標(biāo)，更新標(biāo)準(zhǔn)曲線；質(zhì)控結(jié)果不理想的時(shí)候，也要考慮更新標(biāo)準(zhǔn)曲線。 通常使用商品化的標(biāo)準(zhǔn)血漿建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)示值需溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不推薦自制定標(biāo)血漿。

一期法是目前最常見(jiàn)的凝血因子活性測(cè)定方法，采用一期法檢測(cè)FⅧ，至少應(yīng)進(jìn)行2 個(gè)稀釋度的檢測(cè)，有條件可以進(jìn)行3 個(gè)或3 個(gè)以上稀釋度的檢測(cè)，然后判讀結(jié)果［11］。 檢測(cè)結(jié)果與稀釋度的線性關(guān)系與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，可以提示是否存在抗凝物或樣本活化，同時(shí)也可以提高結(jié)果的可靠性。 應(yīng)保證檢測(cè)的結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限時(shí)，直接檢測(cè)得到的結(jié)果就不可靠，需要選用稀釋后檢測(cè)的結(jié)果。

9 全自動(dòng)血凝儀操作的質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照儀器試劑生產(chǎn)廠商的操作說(shuō)明制定符合自己實(shí)驗(yàn)室要求的凝血因子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件的要求進(jìn)行操作。 全自動(dòng)血凝儀需要定期保養(yǎng)和校準(zhǔn)，排除如光源不穩(wěn)定、溫度波動(dòng)等機(jī)器故障影響。 全自動(dòng)血凝儀宜選擇使用配套試劑開(kāi)展檢測(cè)。 如使用非配套試劑，應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。 試劑應(yīng)按照貯存條件妥善保存并在有效期內(nèi)使用。

10 FⅧ活性測(cè)定試驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保證每次開(kāi)機(jī)檢測(cè)凝血因子時(shí)都進(jìn)行一次正常水平和異常水平的室內(nèi)質(zhì)控。 目前我們實(shí)驗(yàn)室使用正常水平和異常水平兩種商業(yè)質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，還用冰凍血漿自制質(zhì)控血漿同步檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

商業(yè)質(zhì)控品血漿在復(fù)溶后允許凍融一次，可以在復(fù)溶后分裝凍存，在-70 ℃條件下最多可保存6個(gè)月。

當(dāng)質(zhì)控結(jié)果在允許范圍之外時(shí)，需要明確失控的具體原因，并采取恰當(dāng)?shù)募m正措施。 只有質(zhì)控結(jié)果在允許范圍內(nèi)時(shí)，才可以發(fā)放檢測(cè)報(bào)告。

11 FⅧ活性測(cè)定的室間質(zhì)評(píng)和比對(duì)

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)組織開(kāi)展的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，以保證采用相同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)之間結(jié)果的可比性。 我中心出凝血實(shí)驗(yàn)室對(duì)外檢測(cè)全部凝血因子及VWF 抗原和活性，實(shí)驗(yàn)室從2006年開(kāi)始參加英國(guó)謝菲爾德的國(guó)際出凝血室間質(zhì)評(píng)，目前還參加國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心的凝血因子室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目。

2014 年，國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心針對(duì)72家開(kāi)展凝血因子檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行調(diào)查，僅有44 家開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)控，占61%，僅有17 家參加室間質(zhì)評(píng)［12］。 國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心目前已經(jīng)開(kāi)展了凝血因子室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目，針對(duì)所有開(kāi)展凝血因子檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，有條件的血站也可以報(bào)名參加。

12 人員培訓(xùn)

凝血因子檢測(cè)需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，才能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。 世界血友病聯(lián)盟發(fā)布的血友病管理指南，其中實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)部分指出，準(zhǔn)確的凝血因子檢測(cè)，需要經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員；進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)人員需要了解凝血因子檢測(cè)的原理，并且在條件許可的情況下到專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)中心進(jìn)行培訓(xùn)［13］。

13 結(jié) 語(yǔ)

質(zhì)量抽檢是確保冷沉淀質(zhì)量合格，臨床使用有效的重要保障，只有保證檢測(cè)過(guò)程合理、檢測(cè)結(jié)果可靠，才是有效的質(zhì)量抽檢。 我們的認(rèn)識(shí)也有不足的地方，檢測(cè)中的注意事項(xiàng)隨著儀器和方法的更新，也會(huì)有改變，只有持續(xù)不斷的學(xué)習(xí)，才能保證檢測(cè)結(jié)果和質(zhì)量抽檢結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

冷沉淀的質(zhì)量要求最終還是取決于用途，隨著冷沉淀使用范圍的改變，冷沉淀的質(zhì)量要求也應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。 衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)科輸血（WST622-2018）中，冷沉淀凝血因子的使用范圍是：適用于FⅧ和／或FXIII 和／或VWF 和／或纖維蛋白原等缺乏的治療性輸注［14］。 但用于低纖維蛋白原血癥或血友病患者的規(guī)則都是在藥源性纖維蛋白原和藥源性FⅧ濃縮物無(wú)法獲得時(shí)輸注。 目前針對(duì)冷沉淀凝血因子的質(zhì)量要求，主要關(guān)注FⅧ和纖維蛋白原的含量，對(duì)于VWF 和凝血因子X(jué)III 重視不夠。 國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)專(zhuān)門(mén)治療血管性血友病患者（VWD）和凝血因子X(jué)III 缺乏患者的血漿制品，出血時(shí)治療的首選是冷沉淀，隨著冷沉淀使用范圍的改變，我們也應(yīng)該更重視冷沉淀中的VWF 和凝血因子X(jué)III 的含量。

作者貢獻(xiàn)聲明房云海負(fù)責(zé)撰寫(xiě)文章；張心聲負(fù)責(zé)修改文章

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突