小紅參免疫作用及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

張 希，東方梓涵，李 江，戚琬若，劉 旭，鄒昱蕾，余曉玲*

(1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118)

小紅參，又名滇紫參，別稱活血、小活血、小紅藥、紅根、小茜草、小舒筋、色子片等，為茜草科植物云南茜草[Rubiayunnanensis(Franch.) Diels]的干燥根及根莖，是云南、貴州少數(shù)民族特色藥用植物之一，彝醫(yī)稱其為“乃佐色”，意譯為“小紅藥”[1]。

小紅參具有活血通經(jīng)、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)靜止痛等功效，常用于治療女性痛經(jīng)閉經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻、黃褐斑、不孕癥，以及跌打勞傷、關(guān)節(jié)風(fēng)濕疼痛、咳嗽氣喘、頭昏腦脹、胃脘痛、心煩失眠等[2]。現(xiàn)代研究明確其藥理作用主要有抗心肌缺血、抗腫瘤、抗氧化、抑制NO、治療銀屑病、升白以及祛痰等[3]，臨床主要用于皮膚病、外科、心血管、腫瘤及呼吸系統(tǒng)疾病的治療。近幾年關(guān)于小紅參的臨床應(yīng)用研究主要集中在抗癌、抗心肌缺血以及治療銀屑病等方面。另外，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)活血化瘀類中藥除了具有較強(qiáng)的抗凝血作用外，還有免疫炎癥調(diào)節(jié)作用，因此本研究以活血化瘀藥小紅參的主要臨床藥理作用為研究基礎(chǔ)，總結(jié)其在免疫調(diào)節(jié)方面的作用機(jī)制，為小紅參多靶點(diǎn)藥理作用的機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量控制是臨床安全用藥的基本保證，目前對(duì)于中藥質(zhì)量的分析大多參考藥物中單個(gè)或多個(gè)成分的含量作為質(zhì)量控制依據(jù)，而該成分的選擇可能是因?yàn)橐追蛛x、易指認(rèn)或含量較大等原因，因此存在藥效關(guān)聯(lián)度差、有效成分物質(zhì)基礎(chǔ)不明確以及缺少特定有效成分對(duì)藥材整體把控等情況。因此，劉昌孝院士提出的中藥質(zhì)量標(biāo)志物概念，認(rèn)為質(zhì)量標(biāo)志物是中藥材和中藥產(chǎn)品(包括中藥飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑)中固有的或加工制備過(guò)程中形成的，與中藥功能密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)[4]，這些化學(xué)物質(zhì)對(duì)于中藥質(zhì)量控制有重要作用[5]。本研究從傳統(tǒng)藥效、新藥效、成分特有性及成分可測(cè)性4個(gè)方面，對(duì)小紅參質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)的成分進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 小紅參的免疫作用

1.1 治療銀屑病的免疫機(jī)制

銀屑病是一種慢性易復(fù)發(fā)的炎癥性皮膚疾病，其具體發(fā)病機(jī)制目前仍處于研究中，但可明確的是銀屑病是由多基因改變引起的遺傳病，是一種以T淋巴細(xì)胞免疫介導(dǎo)為主、在多種免疫細(xì)胞共同作用下引起的角朊細(xì)胞異常增殖性皮膚病[6]。銀屑病皮損中先有CD4+T細(xì)胞等進(jìn)入和活化，接著出現(xiàn)CD8+T細(xì)胞，當(dāng)皮損消退時(shí)CD8+T細(xì)胞又逐漸增多，而皮損中CD4+T細(xì)胞減少或消失[7]。呂邵萍等[8]采用小紅參針劑對(duì)尋常型銀屑病患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)患者病情緩解后，外周血中CD3+、CD2+及CD4+數(shù)值均無(wú)明顯改變，而CD8+T細(xì)胞由治療前異常增高降到正常范圍，表明小紅參與了T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)。

適量濃度的小紅參提取物有抑制經(jīng)ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)及其產(chǎn)生IL-2的能力，且隨著給藥劑量等增加，對(duì)其T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的抑制作用增強(qiáng)。但經(jīng)LPS誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖反應(yīng)無(wú)相同抑制效果；體外給藥小紅參蒽醌類及三萜類對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均具有抑制作用，因此小紅參治療銀屑病的作用機(jī)制可能是通過(guò)蒽醌類及三帖類等免疫活性成分調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞從而發(fā)揮作用[9-10]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，急性銀屑病的誘發(fā)及其慢性持續(xù)存在的刺激因素都與鏈球菌感染有關(guān)。戴軍等[11]研究小紅參含藥血清干擾鏈球菌抗原刺激致敏小鼠的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其免疫藥理學(xué)結(jié)果提示小紅參含藥血清有抑制T淋巴細(xì)胞對(duì)鏈球菌超聲抗原的增殖作用，可抑制炎癥因子等釋放，并且其醇提取物含藥血清的抑制作用更明顯，抑制率高達(dá)26%。提示小紅參含藥血清可抑制T淋巴細(xì)胞增殖，且可能醇提取物中蒽醌含量較高，抑制效果更好；表明小紅參可能從細(xì)胞和分子水平抑制免疫炎癥反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)銀屑病患者的免疫功能異常。

1.2 抑制NO的免疫機(jī)制

一氧化氮(NO)作為信使因子和效應(yīng)因子，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。適量NO可在早期固有免疫應(yīng)答中直接或間接抑制和殺傷病原微生物[12]，但過(guò)量的NO易形成炎癥級(jí)聯(lián)動(dòng)反應(yīng)，促使炎癥發(fā)展，導(dǎo)致機(jī)體異常[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血漿中和皮損處NO含量明顯高于正常值，過(guò)量的NO會(huì)導(dǎo)致血管擴(kuò)張和炎癥因子的釋放，且銀屑病皮損處的炎癥細(xì)胞表達(dá)iNOS增加，可進(jìn)一步催化NO生成。顧錦章等[14]對(duì)SLE、接觸性皮炎、濕疹及銀屑病患者血清NO進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，銀屑病患者NO水平明顯升高，而經(jīng)藥物干預(yù)后下降，表明銀屑病的形成機(jī)制可能與NO參與炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)分子相關(guān)。

據(jù)報(bào)道，小紅參含藥血清對(duì)鏈球菌抗原誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的NO分泌有抑制作用。MORIKAWA T等[15]發(fā)現(xiàn)小紅參中紅蕓香醇C、紅蕓香醇A和F、紅蕓香酮C、2-甲基1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌能抑制NO的產(chǎn)生；小紅參根的水-丙酮提取物、乙酸乙酯溶解部分及其從中得到的rubianols-d與rubianols-e的化合物均能抑制脂多糖活化巨噬細(xì)胞中的NO。TAO J等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了小紅參能抑制脂多糖活化的巨噬細(xì)胞中NO的分泌，同時(shí)能抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的誘導(dǎo)。FAN JT等[17-18]研究了小紅參中的茜草素和兩個(gè)新的環(huán)六肽，發(fā)現(xiàn)其能抑制脂多糖及干擾素-γ誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，喬木烷型三萜類化合物能夠抑制血小板聚集和NO的產(chǎn)生[19]，而從小紅參中分離出的主要三萜類成分茜草喬木醇G(RG)也屬于喬木烷型[20]，表明小紅參可能通過(guò)抑制NO的分泌及iNOS的誘導(dǎo)從而緩解皮損癥狀，以調(diào)節(jié)炎癥局部的免疫狀態(tài)，在細(xì)胞和分子水平抑制免疫炎癥反應(yīng)。

然而，到目前為止，關(guān)于小紅參通過(guò)抑制NO來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能及其亞群提高免疫功能的相關(guān)研究報(bào)道較少，其作用機(jī)理及信號(hào)通路尚不明確。因此將小紅參作為NO、iNOS的抑制劑，研究新的抗炎免疫的治療途徑，具有重要的醫(yī)療價(jià)值。

1.3 炎癥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

小紅參具有活血化瘀、養(yǎng)血生新的功效，近幾年研究發(fā)現(xiàn)小紅參在抗心肌缺血(再灌注損傷)、抗癌及抗氧化方面具有良好療效。

現(xiàn)代研究表明，在缺血性心臟病的發(fā)展過(guò)程中天然免疫應(yīng)答具有關(guān)鍵性作用。TLRs被缺血性再灌注損傷的心臟組織激活后產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其主要機(jī)制是促進(jìn)NF-κB活化及炎性因子的產(chǎn)生[21]。NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也被研究證實(shí)與多種炎癥性、自身免疫性、腫瘤性疾病的易感性有關(guān)[22]。FAN JT等[18]研究發(fā)現(xiàn)小紅參中rubiyunnanin D、RA-I、RA-V、RA-XXIV、RY-I能顯著抑制HEK-293-NF-κB 熒光素酶，穩(wěn)定細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化。ZENG等[20]研究小紅參中三萜類化合物茜草喬木醇G(RG)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)激活的影響，結(jié)果表明，RG可有效抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)激活。另外，小紅參中環(huán)肽類RA-V也能有效抑制NF-κB通路的激活，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制HUVEC和HMEC-1內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[23]。

p65是NF-κB信號(hào)通路成分之一，已有研究證實(shí)，小紅參可通過(guò)阻礙NF-κB p65的磷酸化，進(jìn)而抑制MI/R大鼠心肌細(xì)胞凋亡[24]。小紅參中三萜類化合物RG可通過(guò)下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)，減弱NF-κB p65的轉(zhuǎn)位，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)控下游p53、cyclin D1、Bcl-2和胱天冬酰胺酶，從而觸發(fā)HeLa細(xì)胞的凋亡和G0/G1阻滯。

Nrf2在細(xì)胞各種氧化應(yīng)激損傷調(diào)節(jié)中具有重要作用，其在氧化應(yīng)激作用下被激活，致使下游HO-1的表達(dá)，通過(guò)抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，對(duì)心血管疾病起到保護(hù)作用[25]。RA-XII為小紅參中分離得的一種天然環(huán)肽，XUSHENG AN等[26]研究發(fā)現(xiàn)RA-XII可通過(guò)阻斷Nrf2和HO-1調(diào)控的IκBa/NF-κB和MAPKs信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，延緩LPS誘導(dǎo)的炎癥模型小鼠死亡，并能增強(qiáng)腎組織切片中HO-1和Nrf2的表達(dá)。體外研究表明 Nrf2和HO-1抑制后，RA-XII的抗炎作用被部分逆轉(zhuǎn)。此外，RA-XII暴露可明顯降低促炎細(xì)胞因子的釋放，包括白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-8，并抑制IκB/NF-κB和MAPK等磷酸化。

通過(guò)對(duì)小紅參相關(guān)藥理活性機(jī)制的深入研究探討，發(fā)現(xiàn)小紅參的多種活性成分可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB、TNF-α、HO-1、Nrf2、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8等靶點(diǎn)發(fā)揮其抗炎作用，而這些靶點(diǎn)在小紅參抗癌、抗氧化以及抗心肌缺血等藥理活性中發(fā)揮著重要作用，且這些靶點(diǎn)均為免疫炎癥調(diào)節(jié)中的重要靶點(diǎn)。表明小紅參可能參與了對(duì)免疫系統(tǒng)的修飾及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控，且可能發(fā)揮了重要作用。

2 小紅參質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

本研究主要從傳統(tǒng)藥效、新的藥效、成分特有性及成分可測(cè)性4個(gè)方面對(duì)小紅參質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)進(jìn)行分析。

2.1 基于傳統(tǒng)藥效的質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

小紅參功效主要在于活血祛瘀生新、通絡(luò)鎮(zhèn)靜止痛，可對(duì)應(yīng)用于心血管、腫瘤、外科、婦科、皮膚科等方面的疾病。小紅參提取物Ⅱ-A可提高小鼠ATP含量及耐氧能力[27]，喬木烷型三萜類和游離蒽醌具有降血脂活性[28]，1，2-二羥基蒽醌和1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌可抗血小板聚集，茜草酮A與茜草醇A在低濃度時(shí)呈現(xiàn)出抗血小板聚集活性[29]，這與小紅參在治療心血管疾病與傳統(tǒng)藥效的活血祛瘀功效一致。小紅參醌、環(huán)已肽配糖體、RY-I及RY-I的苷元RA-V、RY-II具有抗癌活性[30-31]，MTA可誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡[32]，具有抗腫瘤活性。茜草喬木醇G(RG)對(duì)人類7種癌細(xì)胞系表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性[33]。小紅參中的環(huán)己肽類化合物能抑制腹水癌(艾氏)、結(jié)腸癌、Lewis肺癌、實(shí)體癌、B-16黑色素瘤和白血病等[34]。FAN JT等[18]發(fā)現(xiàn)小紅參中的茜草素和環(huán)六肽均能抑制癌細(xì)胞毒性，RA-I、RA-V、RY-I、RY-II、RA-XXIV、rubiyunnanin B-H對(duì)11種癌細(xì)胞株呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性，且rubiyunnanin B依賴于融合的絡(luò)氨酸殘基的糖基化而表現(xiàn)出顯著的抗癌譜，表明小紅參中蒽醌類、三萜類的茜草喬木酮、茜草喬木醇及環(huán)己肽類成分可作為傳統(tǒng)藥效的質(zhì)量標(biāo)志物成分。

2.2 基于新藥效的質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

通過(guò)總結(jié)小紅參的藥理作用可知，其提取物Ⅱ-A可以升高白細(xì)胞[35]，小紅參醌具有抗氧化和抑制腸道細(xì)菌易位作用，茜草酮A(1)能抑制枯草芽孢桿菌活性[36]，紅蕓香醇C、紅蕓香醇A和F、紅蕓香酮 C和2-甲基1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌、喬木型三萜、茜草素及環(huán)肽類能抑制NO 的產(chǎn)生；蒽醌類提取物及三萜類可抑制T淋巴細(xì)胞增殖。2-甲基1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌對(duì)RBL-2H3細(xì)胞中β-己糖胺酶的釋放表現(xiàn)出抑制活性作用[16]，表明小紅參中這些化合物可作為新的藥效質(zhì)量標(biāo)志物成分。

2.3 基于成分特有性的質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

一般來(lái)說(shuō)，成分“特有性”體現(xiàn)在2個(gè)不同層次：①能代表和反映同一類藥材的共有性并區(qū)別于其他類藥材的特征性成分；②能反映同一類、不同種藥材之間的差異性成分，可分為種類和含量?jī)蓚€(gè)層次[37]。但這只是表明了可測(cè)性，中藥本身是復(fù)雜的化合物組合，中藥本身的次生代謝產(chǎn)物和機(jī)體吸收過(guò)程中產(chǎn)生的內(nèi)、外源性代謝產(chǎn)物也可作為成分“特有性”的指標(biāo)之一，但目前關(guān)于其代謝產(chǎn)物鮮有報(bào)道。迄今報(bào)道的小紅參化學(xué)成分主要有蒽醌類、喬木烷型三萜類、環(huán)己肽類等，及少量香豆素、木脂素、芳香酸、甾體醇等成分類型[38]，其中小紅參醌、小紅參醌苷、小紅參醌丙等總蒽醌類為其特征性成分，但近幾年，有學(xué)者開(kāi)始對(duì)其環(huán)肽類產(chǎn)生興趣，這可能會(huì)成為小紅參進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的特有性成分之一。

2.4 基于成分可測(cè)性的質(zhì)量標(biāo)志物研究

關(guān)于小紅參的標(biāo)準(zhǔn)目前有《中國(guó)藥典》(1977年版一部)、《貴州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1988年版)、《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版，第二冊(cè)彝族藥)、《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn))。《中國(guó)藥典》自1977年后的版本未對(duì)其收錄，近幾年地方標(biāo)準(zhǔn)也未有更新，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)也只對(duì)小紅參的基源、性狀、顯微、水分、灰分、酸灰及浸出物作了規(guī)定，但缺少關(guān)于其的定性和定量研究。李準(zhǔn)[39]分別采用RP-HPLC和分光光度法測(cè)定小紅參醌苷和小紅參總蒽醌的含量，并通過(guò)分離鑒定出化合物1-羥基-4-O-β-D-葡萄糖萘酚苷，其余關(guān)于小紅參標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜及其特征性成分的檢測(cè)未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，為了民族藥小紅參更好的挖掘利用，需要對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其代表的指標(biāo)性成分進(jìn)行深入研究。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道提示中藥及中成藥在免疫調(diào)節(jié)及抗炎方面具有較好的療效，并且認(rèn)為活血化瘀類中藥在防治心血管疾病的過(guò)程中，除了有抗凝血作用外，還可能參與了免疫系統(tǒng)的修飾及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。小紅參作為活血化瘀類民族藥目前已用于抗腫瘤、抗心肌缺血、抗氧化、治療銀屑病等多種方面，但通過(guò)對(duì)小紅參治療病癥相關(guān)機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥介導(dǎo)因子，抑制多個(gè)活性靶點(diǎn)來(lái)終止和緩解炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療效果?？傮w而言，小紅參在治療疾病方面運(yùn)用廣泛，涵蓋了外科、婦科、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，但是關(guān)于其相關(guān)治療機(jī)制及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不太明確，更多局限于某一類或某一部位成分，缺少“譜-效-量”之間的相關(guān)性研究。

本研究還對(duì)小紅參的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)小紅參的主要活性成分包括小紅參醌、2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌、茜草喬木醇G、茜草喬木酮(a、b、乙、丙等)及環(huán)肽類等，由于小紅參本身成分復(fù)雜且有效物質(zhì)含量較少，沒(méi)有特定明確的物質(zhì)基礎(chǔ)成分，并且小紅參的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，缺少與現(xiàn)代技術(shù)接軌的相關(guān)分析研究，更多局限于簡(jiǎn)單的基礎(chǔ)鑒定；另外，小紅參本身的生長(zhǎng)范圍有限，大多集中在西南、西部一帶，這也為藥材標(biāo)準(zhǔn)的建立增加了難度。因此，為了進(jìn)一步明確小紅參的質(zhì)量標(biāo)志物成分，需要對(duì)小紅參的化學(xué)成分做進(jìn)一步研究。

近幾年，民族藥的臨床應(yīng)用研究逐漸增加，其功效被逐漸發(fā)掘，其藥用范圍也逐漸擴(kuò)大。小紅參作為活血化瘀藥的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制目前仍處于初步研究階段，還有很大的探索開(kāi)發(fā)空間，值得繼續(xù)深入研究。作為重要的云南民族藥用植物之一，小紅參不能局限于作為地方藥材使用，其傳統(tǒng)藥效和新藥效的挖掘利用都具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。