京尼平鞏膜交聯(lián)對(duì)形覺剝奪性近視模型兔安全性的研究

許寅聰，陳 達(dá)，陳 靜，劉超敏，李 娟，王超英，張素華，趙亞芳

目前，全球近視人口數(shù)量不斷增長(zhǎng)，近視發(fā)病率過快增長(zhǎng)已引起社會(huì)高度關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界高度近視患者約有1.63億[1-2]。61.7%的高度近視人群會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，特別是當(dāng)近視度數(shù)超過-10.00 D時(shí)，極易出現(xiàn)黃斑病變[3-4]，引起患者生活質(zhì)量嚴(yán)重降低，帶來沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)，且臨床上缺乏控制近視的有效手段。受到紫外線A-核黃素角膜交聯(lián)技術(shù)在角膜疾病中應(yīng)用的啟發(fā)[5-6]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者積極探索鞏膜膠原交聯(lián)方法并希望將其應(yīng)用于病理性近視的治療中，目前鞏膜的交聯(lián)方法分為物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)兩種[7]。本實(shí)驗(yàn)為探索化學(xué)交聯(lián)方法，采用后Tenon's囊下注射京尼平的方法，將藥物直接注射于后極部鞏膜，希望引起后極部鞏膜的交聯(lián)效應(yīng)，增強(qiáng)鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度，達(dá)到延緩或抑制近視發(fā)展的目的。京尼平是一種天然交聯(lián)劑，提取自中藥梔子，是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，具有良好的生物相容性和低毒性，因此得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[8-9]。近年國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者圍繞京尼平的交聯(lián)效應(yīng)展開了一系列研究，證明了京尼平確實(shí)可以增強(qiáng)鞏膜的生物力學(xué)強(qiáng)度，但是對(duì)其安全性仍不甚明確[10-12]。故本研究通過觀察形覺剝奪性近視模型兔進(jìn)行京尼平鞏膜交聯(lián)后視網(wǎng)膜的電生理以及視網(wǎng)膜、鞏膜纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維的形態(tài)變化，來評(píng)估京尼平鞏膜交聯(lián)的安全性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 選擇14日齡健康幼兔(新西蘭大白兔)60只(購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不限，在解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心由專人進(jìn)行飼養(yǎng)。研究涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已經(jīng)取得醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)2018-KY-09)。京尼平產(chǎn)地日本。新生牛血清和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。RetiMINER-S型視覺電生理儀購(gòu)自重慶艾爾曦醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立：60只幼兔飼養(yǎng)室溫20～23 ℃，光照與黑暗的周期比例為1∶1。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只幼兔分為空白對(duì)照組、近視模型組和京尼平注射+眼瞼縫合組3組，每組20只，均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼未處理。空白對(duì)照組雙眼均不處理，近視模型組實(shí)驗(yàn)眼進(jìn)行眼瞼縫合，京尼平注射+眼瞼縫合組實(shí)驗(yàn)眼結(jié)膜下注射0.5 mmol/L京尼平0.25 ml，隔日1次，連續(xù)注射4次，每次注射后縫合眼瞼，注射前拆線進(jìn)行下一次注射，第一次和第三次注射部位為鼻上1點(diǎn)鐘方向角膜緣后3 mm Tenon's囊下，第二次和第四次注射部位為顳下7點(diǎn)鐘方向角膜緣后3 mm Tenon's囊下。眼瞼縫合均采用雙“U”字形縫合，使用氧氟沙星眼膏涂眼每日1次，眼瞼縫合共持續(xù)60 d。

1.2.2閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查：實(shí)驗(yàn)60 d后使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分雙眼散瞳，將幼兔置于絕對(duì)暗室進(jìn)行暗適應(yīng)20 min，后固定幼兔，使用氯胺酮注射液35 mg/kg肌內(nèi)注射麻醉，使用0.5%丁卡因進(jìn)行角膜表面麻醉，使用表面涂有氧氟沙星眼膏的角膜電極置于角膜表面(作用電極為鍍金角膜電極，記錄條件符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn))，參考電極和接地極分別安置在幼兔額部正中和耳緣皮下，擺放幼兔頭位置伸入刺激球，使檢測(cè)眼正對(duì)刺激球閃光點(diǎn)。行雙眼F-ERG檢查，順序?yàn)閷?shí)驗(yàn)眼暗適應(yīng)3.0檢查(無背景光，3.0 cd×s/m2，白色閃光，通頻帶1～300 Hz)，對(duì)照眼行暗適應(yīng)3.0檢查。檢查期間對(duì)側(cè)眼始終用遮光眼罩完全遮蓋，所有測(cè)量均由同一名技術(shù)人員完成。

1.2.3病理形態(tài)學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)60 d后，使用氯胺酮注射液(35 mg/kg)肌內(nèi)注射麻醉，選擇空氣栓塞法處死幼兔，固定于手術(shù)臺(tái)上，在無菌條件下取出眼球，清除結(jié)膜及筋膜，保留眼外肌和視神經(jīng)，將眼球標(biāo)記清楚，依次放入眼球保存液1(25%新生牛血清，2% DMSO，2.5%蔗糖)、液2(25%新生牛血清，4% DMSO，5.5%蔗糖)、液3(25%新生牛血清，6% DMSO，7.5%蔗糖)，在每種保存液中浸泡10 min，最后置于眼球保存液4(25%新生牛血清，7.5% DMSO，10.0%蔗糖)中，密封好后放入-196 ℃液氮中保存。運(yùn)輸至光鏡實(shí)驗(yàn)室，將離體兔眼從液氮中取出后放入37 ℃水浴箱中復(fù)溫，然后使用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，于視神經(jīng)顳側(cè)垂直鞏膜連續(xù)切片至外直肌，視神經(jīng)使用垂直視神經(jīng)軸位方向切片，厚度0.5 μm，進(jìn)行HE染色，用光學(xué)顯微鏡逐層觀察視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、鞏膜、眼外肌，并照相記錄。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)3組均進(jìn)行F-ERG檢測(cè)，比較a波振幅、a波潛伏期、b波振幅、b波潛伏期。因考慮需評(píng)估京尼平的不良反應(yīng)，僅對(duì)京尼平注射+眼瞼縫合組進(jìn)行光學(xué)顯微鏡HE染色觀察眼部結(jié)構(gòu)，包括鞏膜、眼外肌、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)，以及觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞、鞏膜膠原纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維排列情況和是否存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2 結(jié)果

2.1F-ERG檢查結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)60 d后對(duì)3組幼兔進(jìn)行F-ERG檢查，分析暗適應(yīng)3.0檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組的a波振幅、b波振幅、b波潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但3組間a波潛伏期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。近視模型組a波振幅、b波振幅、b波潛伏期與空白對(duì)照組和京尼平注射+眼瞼縫合組比較均顯著降低(P<0.05)，但空白對(duì)照組與京尼平注射+眼瞼縫合組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組幼兔實(shí)驗(yàn)眼閃光視網(wǎng)膜電圖檢查結(jié)果比較

2.2病理組織學(xué)觀察 對(duì)京尼平注射+眼瞼縫合組進(jìn)行觀察，角膜、結(jié)膜及鞏膜大體觀察實(shí)驗(yàn)眼與對(duì)照眼之間無明顯差別。見圖1。HE染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)眼發(fā)現(xiàn)鞏膜、眼外肌、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)異常變性壞死視網(wǎng)膜細(xì)胞，鞏膜膠原纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維均排列整齊，所有組織均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

圖1 京尼平注射+眼瞼縫合處理幼兔角膜、結(jié)膜及鞏膜大體觀察

圖2 京尼平注射+眼瞼縫合處理幼兔實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜、鞏膜纖維、神經(jīng)纖維、眼外肌纖維病理組織學(xué)觀察(HE×200)

3 討論

病理性近視的發(fā)病機(jī)制與鞏膜的生物力學(xué)特點(diǎn)和自身的缺點(diǎn)有關(guān)，因?yàn)閺难矍虮谌龑咏Y(jié)構(gòu)的力學(xué)性能來看，在相同應(yīng)力的作用下，從視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜到鞏膜的切線模量呈逐步遞增的趨勢(shì)[13]，而鞏膜膠原纖維在后鞏膜葡萄腫形成過程中起到了至關(guān)重要的作用。目前臨床治療病理性近視方法匱乏，國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用相對(duì)廣泛的是后鞏膜加固術(shù)，手術(shù)對(duì)于高度近視黃斑裂孔、阻止眼球繼續(xù)增長(zhǎng)具有一定效果[14]，但其長(zhǎng)期有效性及安全性仍需觀察。目前，探索鞏膜膠原交聯(lián)方法并用于病理性近視的治療成為研究熱點(diǎn)，其中天然交聯(lián)劑京尼平因具有優(yōu)良生物相容性和低毒性在眾多交聯(lián)劑中脫穎而出，本文圍繞京尼平鞏膜交聯(lián)的安全性進(jìn)行研究。

本研究設(shè)計(jì)了3組，分別為空白對(duì)照組、近視模型組、京尼平注射+眼瞼縫合組，這樣分組的目的是為更全面觀察形覺剝奪性近視模型兔中京尼平鞏膜交聯(lián)的安全性。在視網(wǎng)膜電生理檢查指標(biāo)中選擇F-ERG暗適應(yīng)3.0檢查，這是因?yàn)槟壳芭R床應(yīng)用的各項(xiàng)檢查中只有暗適應(yīng)3.0檢查可綜合反映視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞混合系統(tǒng)功能，其主要觀察指標(biāo)是a、b波的潛伏期和振幅，a波反映視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的功能，b波反映雙極細(xì)胞的功能。之所以選擇幼兔作為動(dòng)物模型是因?yàn)槌錾?4～74 d處于眼球的快速發(fā)育階段[15]，此階段有利于形覺剝奪性近視模型建立，同時(shí)也模擬了病理性近視眼軸延長(zhǎng)的過程。

本文F-ERG暗適應(yīng)3.0檢查結(jié)果顯示，近視模型組實(shí)驗(yàn)眼的a波振幅、b波振幅較空白對(duì)照組出現(xiàn)了顯著的降低，說明在形覺剝奪60 d后幼兔發(fā)生了近視化，與此同時(shí)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能出現(xiàn)下降。本研究還顯示，京尼平注射+眼瞼縫合組的a波振幅及潛伏期、b波振幅及潛伏期均無異常，這除了說明京尼平鞏膜交聯(lián)有良好安全性外，還證明其可通過控制鞏膜擴(kuò)張起到保護(hù)剝奪性近視致視網(wǎng)膜功能損傷作用。

考慮到在實(shí)際注射京尼平后，藥物存在局部擴(kuò)散使得京尼平鞏膜交聯(lián)不具備特異性，鞏膜周圍的眼外肌、視神經(jīng)、血管等組織均存在被交聯(lián)的可能性，所以本研究又觀察了京尼平注射+眼瞼縫合組實(shí)驗(yàn)眼的病理學(xué)形態(tài)改變，使用光學(xué)顯微鏡HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，鞏膜、眼外肌、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)異常變性壞死視網(wǎng)膜細(xì)胞，鞏膜膠原纖維、視神經(jīng)纖維、眼外肌纖維均排列整齊，所有組織均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這說明京尼平對(duì)于視網(wǎng)膜、鞏膜、視神經(jīng)、眼外肌是安全的。但本研究?jī)H選擇使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查，未能使用高倍電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的微結(jié)構(gòu)改變，今后需進(jìn)行補(bǔ)充以使結(jié)果更具有說服力。

前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)形覺剝奪性近視模型兔進(jìn)行京尼平鞏膜交聯(lián)后的鞏膜條帶彈性模量、極限應(yīng)力均出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，極限應(yīng)變、蠕變率出現(xiàn)降低，說明交聯(lián)后鞏膜不易發(fā)生變形擴(kuò)張[16]。HOANG等[17]也通過熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，京尼平交聯(lián)活體兔眼鞏膜后會(huì)提高其收縮溫度，闡明了后Tenon's囊下注射京尼平可以提高鞏膜的生物力學(xué)強(qiáng)度，有效阻止近視的發(fā)生發(fā)展。

總之，對(duì)形覺剝奪性近視模型兔眼后Tenon's囊下注射京尼平進(jìn)行鞏膜膠原交聯(lián)能提高鞏膜生物力學(xué)強(qiáng)度，有效阻止動(dòng)物模型近視眼發(fā)展；有良好安全性，不會(huì)損傷視網(wǎng)膜視細(xì)胞功能，對(duì)鞏膜、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)及眼外肌細(xì)胞不會(huì)構(gòu)成形態(tài)學(xué)損傷。