銅死亡與腫瘤的關(guān)系研究進展

黃本林，付 瑞，王 寧，李曉東，孫繼芹，朱星成，段 勇

作為參與能量轉(zhuǎn)換、鐵收集、氧運輸和細胞內(nèi)氧化代謝必需酶的催化輔助因子，細胞中適量的銅對生命活動是不可替代的[1]。然而，通過穩(wěn)態(tài)機制可以確保細胞內(nèi)的銅濃度維持在低水平，以防止細胞內(nèi)有害游離銅的積累[2]。另一方面，銅固有的氧化還原特性使其對細胞既有益又有潛在毒性。Cu2+和Cu+是銅的兩種氧化態(tài)，其中Cu+被認為是細胞質(zhì)還原環(huán)境中的主要形式。其他必需金屬，如鐵的毒性機制已經(jīng)明確，但銅誘導的細胞毒性機制仍舊是個謎團。 最近TSVETKOV等[3]揭示了一種新的細胞死亡形式，銅依賴的細胞死亡(簡稱為銅死亡)，為一種非凋亡細胞死亡途徑。他們已經(jīng)證明，銅可以直接與三羧酸循環(huán)(TCA)中的脂?；煞纸Y(jié)合，這些銅結(jié)合脂質(zhì)化線粒體蛋白的聚集及隨之出現(xiàn)Fe-S簇蛋白的丟失,引發(fā)了蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激和一種獨特形式的細胞死亡。遺憾的是，國內(nèi)暫無銅相關(guān)細胞毒性的基礎(chǔ)研究和臨床試驗。為此，我們對銅死亡相關(guān)疾病生物學標志物和治療方法及藥物面臨的機遇與挑戰(zhàn)進行如下綜述。

1 銅與腫瘤

1.1銅增生 GE等[4]首次提出銅增生的概念，即依賴銅的生長或增殖，描述了銅通過信號通路的主要和次要效應(yīng)，包括酶促和非酶促銅調(diào)節(jié)活動。銅增生將成為藥理學目標，銅信號可以被銅選擇性螯合劑抑制，或者可以被金屬離子載體激活，從而提高銅水平或在空間和時間上重新分配到細胞和亞細胞池中。與鐵死亡相似，銅還可以通過線粒體依賴性能量代謝增加和活性氧積累引起的細胞毒性介導細胞死亡，這一過程被稱為“銅死亡”[5]。所以，銅死亡的首次提出存在一定爭議，但確實是TSVETKOV等[3]首次闡明銅死亡的作用機制。

1.2銅穩(wěn)態(tài) 和其他金屬一樣，細胞內(nèi)銅分布池分為2個部分：緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)池(微摩爾級別)和生物可利用的不穩(wěn)定池(飛摩爾水平)[6-7]。銅藍蛋白是哺乳動物血漿中可交換性銅的主要蛋白載體[7]，其他如細胞質(zhì)金屬伴侶(ATOX1)及細胞質(zhì)-線粒體金屬伴侶蛋白等兼具銅轉(zhuǎn)出和金屬伴侶的功能[8-9]，共同維持適當?shù)募毎麅?nèi)銅生物利用度，并確保銅依賴酶的金屬化，包括細胞色素c氧化酶、超氧化物歧化酶等[7]。

1.3腫瘤中的銅狀態(tài) Wilson病患者肝癌發(fā)生風險上升，提示異常的銅積累可能通過一種未知的機制促進細胞惡性轉(zhuǎn)化[10]。從某種程度而言，與非分裂細胞相比，癌細胞對銅的需求更高[11-12]。據(jù)報道，已經(jīng)在動物模型和多種腫瘤患者腫瘤組織或血清中觀察到銅濃度的升高[11]。銅失衡會影響線粒體呼吸、導致糖酵解、胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝的變化[13-15]，也可通過ATOX-ATP7A-LOX途徑促進轉(zhuǎn)移性擴張[9]，通過ULK1和ULK2調(diào)節(jié)自噬[16]，激活血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子2、腫瘤壞死因子和白細胞介素-1，從而促進血管新生導致腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。

1.4銅靶向治療策略 對于銅穩(wěn)態(tài)相關(guān)遺傳性疾病，銅離子載體和銅螯合劑均被認為是臨床常用的有效治療藥物[17-21]。然而在腫瘤方面，對銅毒性的研究卻沒有那么成功[22]。雖然依爾氯莫爾(銅離子載體)已經(jīng)開展了相關(guān)臨床試驗，但是這種試驗既沒有探索到生物學標志物，也未對藥物作用機制進行深入了解[23]。因此，未來應(yīng)該考慮使用生物學標志物進行銅離子載體的臨床試驗，這將對銅靶向治療策略的開發(fā)具有重要意義。

2 銅死亡與腫瘤

2.1銅死亡 既往結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系實驗表明，修飾銅結(jié)合小分子化合物的能力將導致細胞殺傷力減弱，銅螯合劑消除了該化合物的細胞毒性[24]。為了進一步確定銅離子載體的細胞毒性是否依賴于銅本身，分析伊利司莫(ES，一種強效銅離子載體)的殺傷潛力就顯得非常關(guān)鍵。首先，有學者研究銅離子載體的毒性是否依賴于已知細胞死亡模式的誘導，實驗顯示，通過藥物或基因敲除的方法抑制細胞凋亡，并不能抑制多個腫瘤細胞系中ES-Cu復合物誘導的細胞死亡。還發(fā)現(xiàn)，親水抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)通過螯合細胞內(nèi)銅來阻斷ES-Cu的毒性，N-乙酰半胱氨酸、α-生育酚、依布硒等抗氧化劑并不能逆轉(zhuǎn)ES-Cu的生長抑制作用，這表明活性氧不是銅死亡必需的[3]。后續(xù)一系列結(jié)果表明，銅離子載體誘導的細胞死亡主要依賴于細胞內(nèi)銅的積累。最終，提出了“銅死亡”的全新概念，即不斷積累的銅與TCA中的脂?；煞种苯咏Y(jié)合，引起脂?；鞍拙奂碗S后的Fe-S簇蛋白丟失，導致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激和最終的細胞死亡。這是一種新的非凋亡細胞死亡途徑，不同于其他已知的調(diào)控細胞死亡機制，包括凋亡、焦亡、壞死和鐵死亡。

ES在細胞外結(jié)合Cu2+，并將其運輸?shù)郊毎麧{，銅離子積累主要通過FDX1介導的線粒體蛋白毒性應(yīng)激引起銅死亡。一方面，F(xiàn)DX1將Cu2+還原為Cu+，促進參與線粒體TCA調(diào)控的脂?；兔?特別是DLAT)的聚集。另一方面，F(xiàn)DX1引起Fe-S簇蛋白的不穩(wěn)定，除了銅離子載體外，銅轉(zhuǎn)入通道(如SLC31A10)和轉(zhuǎn)出通道(如ATP7B)通過影響細胞內(nèi)Cu+水平來調(diào)節(jié)銅化敏感性。GSH作為一種含硫醇的銅螯合劑，可以阻斷銅死亡的發(fā)生，而丁硫胺酸亞砜胺則通過耗盡GSH來誘導銅死亡。線粒體丙酮酸載體抑制劑UK5099和電子傳遞鏈復合物Ⅰ/Ⅲ抑制劑(如魚藤酮和抗霉素A)可減弱ES誘導的銅死亡。

2.2銅死亡相關(guān)基因(CRGs)預(yù)測腎透明細胞癌(ccRCC)臨床預(yù)后 雖然銅穩(wěn)態(tài)的失調(diào)可能觸發(fā)細胞毒性，但是細胞內(nèi)銅水平的改變可能也影響腫瘤的發(fā)生和進展。最近有研究表明，與健康者相比，腫瘤患者在血清和腫瘤組織中的銅水平顯著升高[13]?；诖?，銅離子載體相關(guān)藥物和銅螯合劑已經(jīng)應(yīng)用于抗腫瘤治療。BIAN等[25]對10個CRGs(CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1和PDHB)在ccRCC中的表達情況展開深入研究。其中，只有CDKN2A在ccRCC中表達上調(diào)，其余9個基因表達下調(diào)。進一步分析發(fā)現(xiàn)CDKN2A、DLAT、FDX1和LIAS與免疫浸潤水平顯著相關(guān)，CDKN2A、FDX1和LIAS與ccRCC患者臨床分級、分期及總體生存率和無進展生存期顯著相關(guān)。

其實，既往研究已經(jīng)表明FDX1是TCA中蛋白脂質(zhì)化過程中的上游調(diào)控因子和銅死亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[26]，二氫硫辛酰胺S-乙酰轉(zhuǎn)移酶(DLAT)是丙酮酸脫氫酶復合體的組成部分，銅和TCA中的脂酰化蛋白結(jié)合后促使DLAT寡聚集，這些均是銅死亡核心機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CDKN2A的表達在細胞周期控制中發(fā)揮作用，并與多種腫瘤的起源密切相關(guān)[27]。根據(jù)一項meta分析發(fā)現(xiàn)，在76%的轉(zhuǎn)移性ccRCC樣本中顯示CDKN2A缺失[28]。更多CRGs的臨床標志物還需要在人群樣本中進行驗證，這將為ccRCC的治療和預(yù)后預(yù)測提供新的選擇。

2.3銅死亡相關(guān)長鏈非編碼RNA(LncRNA)與肝細胞癌(HCC) LncRNA是指長度超過200 nt的RNA，其本身不編碼蛋白，而是以RNA的形式多層面調(diào)控基因的表達。LncRNA與物種進化、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝及腫瘤的發(fā)生等均有密切的關(guān)系。銅離子積累引起的細胞毒性可能調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長和增殖速率，而這與LncRNA的聯(lián)系又如何？ZHANG等[29]在HCC患者腫瘤組織和正常組織中發(fā)現(xiàn)了107個與銅死亡相關(guān)的差異表達的LncRNA(DE-lncRNAs)，其中16個候選DE-lncRNAs與HCC患者預(yù)后高度相關(guān)，最終納入6個DE-lncRNAs建立多因素Cox回歸模型：風險評分=AC138904.1×0.07981-AC099329.2×0.17935+DEPDC1-AS1×0.15452+GIHCG×0.15857+AC145343.1×0.22327-DNMBP-AS1×0.17083，其中AC099329.2、DNMBP-AS1為保護性LncRNA，AC138904.1、DEPDC1-AS1、GIHCG、AC145343.1為風險性LncRNA。AC099329.2和DNMBP-AS1與鐵死亡密切相關(guān)，可作為預(yù)測乳腺癌預(yù)后的新型生物學標志物[30]，與此同時，DNMBP-AS1還參與了鐵死亡在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控過程[31]。既往研究表明，AC145343.1可作為TP53突變相關(guān)的LncRNA參與免疫浸潤的調(diào)控，并預(yù)測HCC患者的預(yù)后[32]。進一步對該多因素Cox回歸模型進行分析，發(fā)現(xiàn)評分較低的患者預(yù)后較好，時間依賴性受試者工作特征曲線分析結(jié)果顯示，該模型對HCC患者1、3、5年生存率預(yù)測的曲線下面積分別為0.739、0.725和0.734。采用ES誘導銅死亡細胞模型，HerpG2細胞株中的AC138904.1、AC099329.2、GIHCG和DNMBP-AS1在藥物治療前后發(fā)生明顯變化，而在MHCC-97H細胞株中，只有AC138904.1、AC099329.2、DNMBP-AS1前后發(fā)生明顯變化，這3個LncRNA與離子轉(zhuǎn)運調(diào)控密切相關(guān)。另一方面，還發(fā)現(xiàn)風險評分較高人群B細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、CD4+T1細胞、CD4+T2細胞浸潤和PD1、CTLA4表達明顯高于低風險評分人群，提示此類患者更適合免疫抑制治療。

2.4CRGs預(yù)測黑色素瘤免疫浸潤和疾病進展 皮膚黑色素瘤(SKCM)由黑色素細胞的惡性轉(zhuǎn)化引起，是最具侵襲性和最致命的皮膚癌類型，雖然僅占所有皮膚癌的1%，但是約占皮膚癌死亡人數(shù)的80%[33]。銅死亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞死亡形式，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用尚不清楚，其在SKCM免疫、靶向治療方面的潛力非常值得挖掘。LV等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，在黑色素瘤中有11個表皮生長相關(guān)突變基因(FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1、MTF1、GLS、CDKN2A、SLC31A1和ATP7B)表達上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)高表達組總生存期更長。其中，LIPT1基因可作為黑色素瘤預(yù)后良好的一個指標，上調(diào)LIPT1可能通過破壞線粒體中的TCA，進而誘導細胞萎縮，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，LIPT1表達與PDL1表達呈正相關(guān)，與調(diào)節(jié)性T細胞浸潤呈負相關(guān)。

2.5銅死亡模型在膠質(zhì)瘤腫瘤-免疫相互作用中的預(yù)測作用 CHEN等[35]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，銅活動評分(CuAS)與腫瘤免疫浸潤有關(guān)，確定了5個信號通路和8個配體-受體對，包括ICAM1、ITGAX、ITGB2、ANXA1-FRR1等，闡明銅死亡與腫瘤細胞和免疫細胞之間的緊密聯(lián)系，并且預(yù)測了13種針對高CuAs膠質(zhì)瘤的潛在藥物，如寡霉素A、雙氫青蒿素等。該銅死亡預(yù)測模型在膠質(zhì)瘤腫瘤-免疫相互作用和個性化治療方面具有一定參考價值。

2.6CRGs在三陰性乳腺癌(TNBC)中的研究 TNBC占浸潤性乳腺癌的15%～20%，具有高異質(zhì)性、侵襲性和復發(fā)風險[36]。缺乏特異性靶向治療藥物，是抗TNBC治療失敗和患者最終死亡的關(guān)鍵原因。銅死亡與腫瘤進展、預(yù)后和免疫反應(yīng)有關(guān)，在TNBC中如何？乳腺癌中CRGs的表達變化具有高度異質(zhì)性，揭示了CRGs表達失衡在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。有研究顯示，采用多因素Cox回歸分析篩選出5個CRGs，其中ATP7A、DLST和LIAS高表達水平與較短的總生存期相關(guān)，而LIPT1和PDHA1高表達水平表明預(yù)后良好[37]。該5個CRGs主要參與生物過程和分子功能，較少參與細胞成分。KEGG代謝通路分析顯示：5個CRGs在TCA中顯著富集，可能通過負調(diào)控線粒體代謝功能影響疾病的發(fā)生。并發(fā)現(xiàn)了以CTLA-4/PD-1抑制劑為代表的免疫檢查點抑制劑治療反應(yīng)。CRG評分組患者僅在抗CTLA-4治療時顯示出顯著的治療效果，這可能部分解釋當前TNBC免疫靶點與免疫治療效果之間的不匹配。ATP7A表達下調(diào)顯著抑制了乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，這與其對乳腺癌患者的促腫瘤作用一致。CRG評分是評估TNBC預(yù)后可靠且獨立的方法，還與藥物敏感性有關(guān)，為提高患者免疫治療的效果、識別不同的TNBC免疫表型、促進未來精準個性化的免疫治療提供了新的思路和方向。

2.7其他腫瘤 基于8個與突變相關(guān)的LncRNA預(yù)后標志物(AL132800.1、AC090587.1、AC079160.1、AC011462.4、AL157888.1、GRHL3-AS1、SNHG16、AC021148.2)構(gòu)建的多因素Cox回歸分析模型，在預(yù)測頭頸部鱗癌對免疫治療藥物敏感性方面具有較好的應(yīng)用前景[38]。HAN等[39]也發(fā)現(xiàn)ADAMTS9-AS1、CASC2、LINC00680、SNHG1、TRG-AS1等LncRNA是軟組織肉瘤的獨立預(yù)后指標，并且可能在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮作用，可為軟組織肉瘤患者治療提供新的治療靶點。也有研究發(fā)現(xiàn)了10個CRGs的LncRNA特征，為結(jié)腸腺癌患者預(yù)后和藥物選擇提供了新方向[40]。

3 挑戰(zhàn)

銅死亡機制的探索無疑為人類疾病治療帶來了很多憧憬，但還迫切需要探索過度積累導致細胞損傷的現(xiàn)象是否是所有金屬的共同特征[23]，特別是對于一些通常用作藥物載體的金屬(如金和硅)。此外，銅在腫瘤中的毒性分子機制及銅死亡演變?yōu)榇_定的細胞死亡的具體模式是否需要進一步闡明？另一方面，考慮到腫瘤中脂?；鞍椎呢S度和呼吸模式的差異，需要在各種疾病模型甚至細胞類型中確定導致細胞毒性的精確濃度范圍，然后建立合理的個性化治療策略。銅誘導細胞毒性的臨床試驗要么基于從適當?shù)幕颊呷后w中發(fā)現(xiàn)生物學標志物，要么基于分子作用機制的深入理解。研究中觀察到，在很多腫瘤中，F(xiàn)DX1的豐度與脂?；鞍赘叨认嚓P(guān)，而含高水平脂?；鞍椎募毎祵︺~死亡非常敏感，表明銅離子載體治療應(yīng)針對具有這種代謝特征的腫瘤[3]。

4 總結(jié)與展望

銅死亡的發(fā)現(xiàn)開啟了一條新的細胞死亡途徑，通過充分利用銅的病理生理作用，為人類疾病防治提供了新思路和可能。冷泉港班伯里中心實驗室已經(jīng)建立了銅癌聯(lián)盟，該領(lǐng)域的快速發(fā)展在不同學科間建立了新的聯(lián)系。經(jīng)過一系列安全性和有效性測試，可以幫助將銅的化學和生物學基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為潛在的臨床療法和潛在的候選藥物，利用銅依賴疾病的易感性，不僅在人類遺傳性疾病方面，還是在腫瘤方面的應(yīng)用前景將會更加不可估量。