大鼠排泄物中ZCY-15排泄特征分析*

陸嘉君，陳冰，林城江

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025）

阿爾茨海默?。ˋD）是最常見的癡呆疾病，屬進(jìn)展緩慢的神經(jīng)退行性疾?。?］，主要病理特征為神經(jīng)細(xì)胞外的β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集和細(xì)胞內(nèi)的tau聚集或神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）的形成［2-3］。AD病例［4］最早于1907年報(bào)道，但其發(fā)病機(jī)制仍未明晰。AD患者的認(rèn)知功能進(jìn)行性喪失可能由腦功能紊亂或中毒、感染和循環(huán)系統(tǒng)異常等因素引起，導(dǎo)致大腦供氧減少、營(yíng)養(yǎng)缺乏及腫瘤發(fā)生等［5-6］。目前，尚無治愈方法，現(xiàn)有方法僅可改善癥狀［7-8］，治療藥物有乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEIs）［9］（包括多奈哌齊［10］、加蘭他明［11］和利凡他明［12］）和應(yīng)用于中重度AD的美金剛［13］。沈陽藥科大學(xué)藥化教研室參照美金剛及其酰胺類似物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成了系列芳香類美金剛類似物，同時(shí)，以AD模型大鼠為研究對(duì)象，通過Morris水迷宮試驗(yàn)、Y迷宮試驗(yàn)和新物體辨別等試驗(yàn)驗(yàn)證了ZCY-15［N-（3，5-二甲基金剛烷-1-基）-N-（3-甲基苯基）脲］具有顯著的抗AD作用，改善學(xué)習(xí)和記憶能力的效果略優(yōu)于美金剛，有成藥潛力［14］。目前國(guó)內(nèi)外未見ZCY-15在大鼠體內(nèi)的排泄研究。本研究中建立了測(cè)定大鼠排泄物中ZCY-15濃度的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，并分析了ZCY-15在大鼠體內(nèi)的排泄特征。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

I-CLASS型超高效液相色譜系統(tǒng)，Xevo TQ-S型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；5810R型全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)，Mix-Mate型渦旋混勻器（德國(guó)Eppendorf公司）；KS-250N型恒溫超聲儀（上?？缕顑x器設(shè)備有限公司）；XP105DR型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）；MD200-2型氮?dú)獯蹈蓛x（上海那艾儀器有限公司）；HX2001T型體重秤（慈溪市天東衡器廠）。

1.2 試藥

ZCY-15（由沈陽藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供，含量≥98.0%）；卡利拉嗪［內(nèi)標(biāo)（IS），中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量≥99.9%］；醋酸銨（天津市大茂化學(xué)試劑廠，含量≥99.9%）；甲醇、乙酸乙酯均為色譜純；乙腈、甲酸均為質(zhì)譜純；水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠60只，雌雄各半，7～9周，體質(zhì)量（220±30）g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2019-0027。將同性別SD大鼠每籠4只地安置于空調(diào)恒溫室進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫20～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日光照12 h，自由進(jìn)食與飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為AcquityUPLCBEHC18柱（100mm×2.1 mm，1.7μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min時(shí)70%A，1.0～2.5 min時(shí)95%A，2.6～4.0 min時(shí)70%A）；流速為0.25 mL/min；柱溫為50℃；進(jìn)樣量為5μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為150℃；霧化氣溫度為350℃；毛細(xì)管離子源電壓為3 000 V；檢測(cè)方式為正離子檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；定量分析的離子反應(yīng)m/z分別為ZCY-15 313.2→163.1，IS：427.2→382.0。

2.2 排泄樣品預(yù)處理

分別精密量取大鼠空白膽汁、尿液樣品各50μL，稱量空白糞便樣品50 mg，精密稱定，分別加水200μL，渦旋振蕩5 min，加乙酸乙酯300μL，混勻，渦旋振蕩5 min，13 000 r/min離 心5 min，精密 量 取上清 液260μL，用氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇100μL復(fù)溶，渦旋振蕩5 min，13 000 r/min離心5 min，精密量取上清液20μL，置EP管中，加流動(dòng)相180μL，渦旋15 s，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。

2.3 溶液制備

取ZCY-15適量，精密稱定，配制成質(zhì)量濃度為1μg/mL的ZCY-15貯備液，用乙腈逐級(jí)稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1，5，10，25，50，100，200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量濃度分別為2，20，160 ng/mL的質(zhì)量控制溶液。4℃保存待用。

取IS適量，精密稱定，配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，用甲醇稀釋并定容，反復(fù)搖勻，得質(zhì)量濃度為50 ng/mL的IS工作液。4℃保存待用。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：ZCY-15為外源性物質(zhì)，故采用大鼠的空白膽汁、尿液及糞便作為標(biāo)準(zhǔn)曲線基質(zhì)。取大鼠空白膽汁、尿液、糞便適量；以及分別加入5μL ZCY-15和IS工作液的50μL大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿，按2.3項(xiàng)下方法操作，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果ZCY-15的保留時(shí)間為2.24 min，內(nèi)標(biāo)為0.95 min。大鼠的膽汁、尿液及糞便中的內(nèi)源性成分不會(huì)干擾ZCY-15和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。詳見圖1。

圖1 大鼠空白排泄物中ZCY-15和IS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.Cariprazine 2.ZCY-15A.Blank sample B.Blank sample+IS C.Blank sample+ZCY-15a.Blank bile b.Blank urine c.Blank fecesFig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of ZCY-15 and IS in the blank excreta of rats

線性關(guān)系考察：精密量取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿50μL，分別加入ZCY-15系列標(biāo)準(zhǔn)溶液5μL，制成質(zhì)量濃度分別為1，5，10，25，50，100，200 ng/mL的模擬梯度膽汁、尿液、糞便勻漿樣品，按2.3項(xiàng)下方法操作，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，以ZCY-15質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3次，結(jié)果見表1。ZCY-15質(zhì)量濃度在1～200 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 大鼠排泄物中ZCY-15的標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=7）Tab.1 Standard curves of ZCY-15 in the excreta of rats（n=7）

準(zhǔn)確度（RE）和精密度試驗(yàn)：取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿樣品，按2.3項(xiàng)下方法操作，設(shè)定定量下限（LLQ）為1.00 ng/mL，低、中、高3種質(zhì)量濃度（2，20，160 ng/mL），ZCY-15每個(gè)質(zhì)量濃度平行6份，與“線性關(guān)系考察項(xiàng)”樣本連續(xù)3 d同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)當(dāng)日回歸方程計(jì)算對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，與實(shí)際制備的樣品質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，計(jì)算得ZCY-15的LLQ和低、中、高質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確度和精密度，詳見表2。結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度均符合生物樣品測(cè)定的規(guī)定要求。

表2 大鼠排泄物中ZCY-15精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the precision test of ZCY-15 in the excreta of rats

提取回收率：取大鼠空白膽汁、尿液、糞便樣品，分別加入2.2項(xiàng)下ZCY-15低、高質(zhì)量濃度（2 ng/mL，160 ng/mL；下同）質(zhì)控溶液和IS工作液各5μL，按2.3項(xiàng)下方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6份，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，記錄對(duì)應(yīng)的色譜峰面積。同時(shí)，精密量取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿50μL，分別加入低、高質(zhì)量濃度ZCY-15質(zhì)控溶液和IS工作液各5μL，經(jīng)處理，每個(gè)濃度平行6份，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，記錄對(duì)應(yīng)的色譜峰面積，計(jì)算ZCY-15的提取回收率，結(jié)果見表3?？梢姡崛』厥章史仙飿悠窚y(cè)定的規(guī)定要求。

表3 大鼠排泄物中ZCY-15的提取回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the extraction recovery test of ZCY-15 in the excreta of rats（n=6）

基質(zhì)效應(yīng)：精密量取大鼠空白膽汁、尿液、糞便勻漿50μL，分別加入2.2項(xiàng)下低、高質(zhì)量濃度ZCY-15質(zhì)控溶液和IS工作液各5μL，渦旋10 s，按2.3項(xiàng)下方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6份進(jìn)樣分析，得色譜峰面積。用水代替勻漿，按2.3項(xiàng)下方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6份，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，以基質(zhì)存在下的色譜峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入ZCY-15和IS）與不含基質(zhì)的色譜峰面積（ZCY-15和IS的純?nèi)芤海┍戎?，?jì)算ZCY-15和IS的基質(zhì)因子，進(jìn)一步以ZCY-15基質(zhì)因子與IS基質(zhì)因子的比值，計(jì)算得內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子。ZCY-15和IS的基質(zhì)效應(yīng)見表4。結(jié)果表明，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)排泄物勻漿樣品的測(cè)定無明顯影響，符合生物樣品測(cè)定的規(guī)定要求。

表4 大鼠排泄物中ZCY-15的基質(zhì)效應(yīng)（n=6）Tab.4 Matrix effects of ZCY-15 in the excreta of rats（n=6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取大鼠空白膽汁、尿液和糞便勻漿樣品，分別加入2.2項(xiàng)下低、高質(zhì)量濃度ZCY-15質(zhì)控溶液和IS工作液各5μL，按2.3項(xiàng)下方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，考察樣品在室溫下放置12 h、3次循環(huán)凍融、樣品處理后在液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置24 h、-20℃凍存30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果含ZCY-15的排泄物勻漿樣品具有良好的穩(wěn)定性，符合生物樣品測(cè)定的規(guī)定要求。結(jié)果見表5至表7。

表5 大鼠膽汁勻漿樣品中ZCY-15的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the stability test of ZCY-15 in bile homogenate samples of rats（n=3）

表7 大鼠糞便勻漿樣品中ZCY-15的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.7 Results of the stability test of ZCY-15 in feces homogenate samples of rats（n=3）

稀釋效應(yīng)：取配制好的質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL ZCY-15的排泄物勻漿樣品10μL，再加入90μL空白排泄物勻漿稀釋，渦旋30 s，按2.3項(xiàng)下方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6份，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，并與定量為100 ng/mL的實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，得出稀釋效應(yīng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)，稀釋的ZCY-15溶液的精密度的RSD為3.95%～6.48%，準(zhǔn)確度為5.24%～10.86%。故超出定量上限的ZCY-15樣品可用空白排泄物勻漿稀釋后制樣檢測(cè)。

表6 大鼠尿液勻漿樣品中ZCY-15的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of the stability test of ZCY-15 in urine homogenate samples of rats（n=3）

2.5 ZCY-15在大鼠膽汁、尿液和糞便中的排泄特征

分組與排泄樣品采集：稱量ZCY-154.50 mg，精密稱定，置10 mL離心管中，加入100μL二甲基亞砜完全溶解，依次加入160μL吐溫-80、1.4 mL丙二醇、1.6 mL聚氧乙烯蓖麻油-EL，37℃恒溫超聲（功率2 000 W，頻率30kHz，下同）混勻5min，使化合物完全溶解，并轉(zhuǎn)移至20 mL帶塞玻璃試管中；精密加入16.74 mL生理鹽水，37℃恒溫超聲處理5 min混勻，制成質(zhì)量濃度為0.225 mg/mL的ZCY-15溶液。給藥前，大鼠禁食12 h，可自由飲水。隨機(jī)選取18只SD大鼠（雌雄各半），稱定體質(zhì)量、標(biāo)記并計(jì)算給藥量。隨機(jī)分為膽汁組、尿液組和糞便組，各6只，雌雄各半。膽汁組大鼠以10%水合氯醛麻醉后迅速完成膽管插管，在大鼠清醒后緩慢灌胃ZCY-15（2.25 mg/kg），并于給藥后0～2 h、2～4 h、4～6 h、6～8 h、8～12 h、12～24 h收集膽汁樣本；尿液組和糞便組分別于灌胃ZCY-15后0～2 h、2～4 h、4～6 h、6～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h、48～72 h，收集尿液及糞便樣本。收集的樣本密封處理，-20℃凍存待用。

實(shí)際排泄勻漿樣本測(cè)定及數(shù)據(jù)處理：采集大鼠膽汁、尿液和糞便樣本，按2.3項(xiàng)下方法操作，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件檢測(cè)，計(jì)算ZCY-15的濃度，繪制藥物累計(jì)排泄量-時(shí)間曲線。

灌胃給藥后，分別采集不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的膽汁、尿液和糞便，測(cè)定ZCY-15濃度并計(jì)算各時(shí)間段內(nèi)不同排泄樣本的平均藥物累積排泄量。結(jié)果所有采集的尿液樣本中ZCY-15的濃度均低于LLQ，未能檢出；膽汁、糞便樣本中ZCY-15的平均藥物積累排泄量及占比見表8和表9；膽汁和糞便勻漿中ZCY-15的排泄率分別為（0.000 2±0.000 09）%和（0.99±0.57）%。膽汁、糞便勻漿中ZCY-15的平均藥物累積排泄量-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠膽汁、糞便中藥物累積排泄量-時(shí)間曲線A.Bile B.FecesFig.2 Cumulative excretion-time curves in bile and feces of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）by gavage

表8 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠膽汁中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.8 Average cumulative excretions and proportions in bile of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

表8 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠膽汁中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.8 Average cumulative excretions and proportions in bile of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

注：-為ZCY-15濃度低于LLQ。表9同。Note：-indicates that the mass concentration of ZCY-15 is lower than the lower limit of quantification（for Tab.8-9）.

時(shí)間0～2 h 2～4 h 4～6 h 6～8 h 8～12 h 12～24 h 24～36 h 36～48 h 48～72 h膽汁排泄量（ng）9.58±5.16 3.92±1.67 2.52±1.15 0.87±0.12--膽汁排泄量占比（%）64.88±13.66 26.91±5.26 14.72±4.43 5.09±0.01--

表9 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠糞便中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.9 Average cumulative excretions and proportions in feces of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

表9 灌胃給藥ZCY-15（2.25 mg/kg）后大鼠糞便中平均藥物累積排泄量及占比（±s，n=6）Tab.9 Average cumulative excretions and proportions in feces of rats after the intragastric administration of ZCY-15（2.25 mg/kg）（±s，n=6）

時(shí)間0～2 h 2～4 h 4～6 h 6～8 h 8～12 h 12～24 h 24～36 h 36～48 h 48～72 h糞便排泄量（ng）-1 000±998.9-2 296±1 892 2 011±727.9 111.1±82.81 35.51±37.11 22.85±28.43 43.35±11.66糞便排泄量占比（%）-12.00±11.98-52.89±28.68 47.86±35.44 2.10±0.92 0.72±0.64 0.44±0.43 0.73±0.08

3 討論

大鼠灌胃給藥ZCY-15后，經(jīng)膽汁排泄的量極少，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，即膽汁勻漿中ZCY-15質(zhì)量濃度逐漸減少并在給藥后約12 h基本排泄結(jié)束，排泄率僅為（0.000 2±0.000 09）%。由此推測(cè)，ZCY-15原形藥物幾乎不經(jīng)膽汁代謝。收集大鼠口服ZCY-15后不同時(shí)間段的尿液樣本，均未能檢出ZCY-15，表明ZCY-15不能以原形經(jīng)尿液排泄。根據(jù)以往ZCY-15藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果可知，大鼠灌胃給藥ZCY-15吸收量較低，生物利用度不高，故推測(cè)ZCY-15經(jīng)糞便排泄量較大。給藥后0～8 h，糞便中ZCY-15的排泄量逐漸升高，給藥后6～8 h達(dá)排泄高峰；給藥后8～24 h，排泄量逐步下降，給藥后24 h排泄基本結(jié)束。但是經(jīng)計(jì)算得ZCY-15經(jīng)糞便排泄率僅為（0.99±0.57）%?？梢?，ZCY-15通過膽汁、尿液和糞便的整體排泄率較低，主要排泄時(shí)間為給藥后0～24 h。

綜上所述，本研究中建立的UPLC-MS/MS法能在4 min內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)定大鼠膽汁、尿液和糞便中ZCY-15的質(zhì)量濃度，僅少量ZCY-15以原形藥物經(jīng)糞便排泄，其余主要以代謝產(chǎn)物的形式排出體外。