藥物中苯胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法研究進(jìn)展*

鄧?guó)Q，朱健萍，盧日剛

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

苯胺類化合物是重要的化工原料，也是活性藥物合成的中間體或降解產(chǎn)物。N-羥基苯胺類、N-?；被健⒈桨泛屯榛〈谋桨肪鶠槟芘c脫氧核糖核酸（DNA）發(fā)生反應(yīng)的警示結(jié)構(gòu)［1-3］，可能具有致癌性和致突變性。很多情況下，苯胺與化學(xué)基團(tuán)偶聯(lián)使得其基因毒性不易顯現(xiàn)，但仍需監(jiān)控含苯胺結(jié)構(gòu)的化合物，以評(píng)價(jià)化合物本身或其中間體、合成副產(chǎn)物或降解雜質(zhì)等的風(fēng)險(xiǎn)。由于藥物中苯胺類雜質(zhì)要求的限度較低，故要求檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)且靈敏度很高，現(xiàn)行測(cè)定方法有氣相色譜（GC）法、液相色譜法等，而色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法在定性、定量方面比其他分析方法更優(yōu)越，應(yīng)用更廣泛。在此，檢索中國(guó)知網(wǎng)和Sci-Hub數(shù)據(jù)庫(kù)藥物中苯胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法的相關(guān)文獻(xiàn)（檢索時(shí)限為自建庫(kù)起至2021年12月15日），分析不同檢測(cè)方法的適用性和優(yōu)劣，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)提出相應(yīng)觀點(diǎn)。

1 GC法

該法優(yōu)點(diǎn)為分離效能好、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析速度快等，適用于揮發(fā)性有機(jī)化合物的定性、定量分析。芳香胺類化合物屬極性半揮發(fā)性有機(jī)物，可采用GC法檢測(cè)，但大部分苯胺類雜質(zhì)的揮發(fā)性不強(qiáng)，導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度較低。GC法適用于熱穩(wěn)定物質(zhì)，如樣品主成分為熱不穩(wěn)定物質(zhì)，高溫降解產(chǎn)物會(huì)影響雜質(zhì)檢測(cè)的專屬性。

張雪玲等［4］采用該法測(cè)定美沙拉嗪緩釋顆粒中苯胺、2-氨基苯酚、4-氨基苯酚的含量，結(jié)果3種雜質(zhì)與主峰分離度良好，回收率為98.04%～103.00%，檢測(cè)限均為0.015μg/mL。王春霞等［5］采用該法測(cè)定鹽酸利多卡因注射液中2，6-二甲基苯胺、單乙基甘氨酰胺二甲苯、甘氨酰二甲苯胺的含量，利用HP-1毛細(xì)管色譜柱可完全分離上述3種雜質(zhì)，方法專屬性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。為降低主成分濃度過高導(dǎo)致的干擾，范婧等［6］采用液液萃取法提取托拉塞米原料中的基因毒性雜質(zhì)鄰硝基甲苯、鄰甲苯胺、對(duì)甲苯胺、間甲苯胺，并采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法進(jìn)行含量測(cè)定；考察了正庚烷、正己烷、二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)的回收率，結(jié)果二氯甲烷萃取能力最佳，4種雜質(zhì)的加樣回收率為80%～115%，定量限為0.3～0.5μg/g。李靖坤等［7］采用GC-MS法檢測(cè)吉非替尼中3，4-二氯苯胺，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，3，4-二氯苯胺質(zhì)量濃度線性范圍為1～100 ng/mL，回收率為92.53%～118.15%，檢測(cè)限達(dá)1μg/mL。

2 高效液相色譜（HPLC）法

該法通過各種色譜柱技術(shù)及聯(lián)用技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)絕大多數(shù)化合物的分離、分析，彌補(bǔ)了GC法難以分析強(qiáng)極性、熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)化合物的不足，是目前苯胺類基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)最常用的色譜方法。

2，6-二甲基苯胺為利多卡因中的常見雜質(zhì)，BEBAWY等［8］采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）法測(cè)定了口腔凝膠中鹽酸氨基吖啶、鹽酸利多卡因及雜質(zhì)2，6-二甲基苯胺的含量，結(jié)果雜質(zhì)與主成分分離良好，2，6-二甲基苯胺檢測(cè)限為0.26μg/mL，可滿足常規(guī)分析需要。萬(wàn)紅艷［9］采用HPLC-UV法分析了利多卡因貼片的有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果利多卡因與2，6-二甲基苯胺等雜質(zhì)分離度良好，雜質(zhì)檢測(cè)限達(dá)0.001μg/mL。分散液液微萃取法因操作簡(jiǎn)便、快速，有機(jī)溶劑消耗少，萃取富集效果好等優(yōu)點(diǎn)受到分析領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。王璇璇等［10］建立了基于六氟異丙醇（HFIP）-正辛醇超分子溶劑的分散液液微萃取以萃取富集鹽酸利多卡因注射液中的2，6-二甲基苯胺，可實(shí)現(xiàn)高效萃取和富集，方法簡(jiǎn)單、快速；采用HPLC-UV法檢測(cè)2，6-二甲基苯胺含量，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢測(cè)限達(dá)0.33 ng/mL。蒲小琴等［11］采用HPLC-UV法測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊中4-羥基-2-（4-氟苯胺）-5，6-二甲基嘧啶等雜質(zhì)含量，方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，能快速同時(shí)測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊中已知雜質(zhì)及未知雜質(zhì)，滿足質(zhì)控要求。涂佳楠等［12］采用HPLC-UV法測(cè)定鋁鎂加混懸液中抑菌劑醋酸氯己定及其降解雜質(zhì)對(duì)氯苯胺的含量，選擇離心并超聲提取的前處理方法，有效降低了主成分的干擾，對(duì)氯苯胺的檢測(cè)限為0.001 2μg/mL。HUANG等［13］在利拉利汀強(qiáng)酸破壞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了未知雜質(zhì)Ⅰ，通過質(zhì)譜、核磁共振譜、紅外光譜等檢測(cè)方法確定了該雜質(zhì)含有N-?；被蓟窘Y(jié)構(gòu)；后采用超高效液相色譜法有效分離了主峰與各雜質(zhì)峰，采集時(shí)間僅需9 min且檢測(cè)靈敏度提高，定量限達(dá)60μg/g，可滿足檢測(cè)需要。趙國(guó)敏等［14］采用二正丁胺為柱前衍生劑，與主成分4-氯-3-（三氟甲基）苯異氰酸酯生成穩(wěn)定的衍生物，從而建立了測(cè)定其雜質(zhì)CTF-苯胺和CTF-脲含量的HPLC-UV法，方法專屬性好、簡(jiǎn)便易行。

反相色譜除常用C18柱外，其他色譜柱如苯基柱可以提供π-π作用，用于含有苯環(huán)或能提供π鍵作用的結(jié)構(gòu)類似物分析；而五氟苯基（PFP）柱除可提供π-π作用外，還可提供偶極作用、靜電作用等，提高了苯環(huán)上位置異構(gòu)體的分辨能力［15］。徐潔［16］比較了不同官能團(tuán)液相色譜柱對(duì)利伐沙班和潛在基因毒性雜質(zhì)4-（4-氨基苯基）-3-嗎啉酮的分離效果，發(fā)現(xiàn)苯基硅烷鍵合柱對(duì)分離度改善作用明顯，推測(cè)原因?yàn)楸交潭ㄏ嗯c不飽和分析物間存在特殊的π-π作用，較C18填料選擇性高，此外，該方法下該雜質(zhì)檢測(cè)限為5μg/g，遠(yuǎn)低于其限度（50μg/g）。王潔等［17］建立了同時(shí)檢測(cè)3-氯-4-氟苯胺（醫(yī)藥工業(yè)中常見的重要中間體）及其5個(gè)具有苯胺結(jié)構(gòu)有關(guān)物質(zhì)的HPLC法。由于主成分及其雜質(zhì)僅為苯環(huán)上化合物間取代基位置及個(gè)數(shù)的微小差異，傳統(tǒng)C18柱無(wú)法區(qū)分。經(jīng)篩選，Thermo Hypersil GOLD PFP柱對(duì)該品種的選擇性較高，且雜質(zhì)和主峰的分離度和峰形最好。

陳鑒東等［18］采用熒光胺作為衍生劑，建立了同時(shí)檢測(cè)對(duì)甲苯磺酸拉帕替尼中的雜質(zhì)3-氯-4-（3-氟苯基甲氧基）苯胺的高效液相色譜-熒光檢測(cè)（HPLC-FLD）法。熒光胺可使具有伯胺結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)被衍生化，而主成分甲苯磺酸拉帕替尼為芳仲胺結(jié)構(gòu)，不參與反應(yīng)，故不干擾測(cè)定。該方法相比于UV法，靈敏度大幅提高，檢測(cè)限達(dá)1μg/g。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法有更高的靈敏度和更強(qiáng)的專屬性，是目前檢測(cè)芳香胺類化合物的另一種重要方法。張?jiān)品宓龋?9］建立了測(cè)定氟胞嘧啶中痕量基因毒性雜質(zhì)N，N-二甲基苯胺含量的HPLC-MS法，定量限達(dá)0.04μg/g。該雜質(zhì)限度為0.25μg/g，而HPLC-UV法的定量限為200μg/g，遠(yuǎn)達(dá)不到要求。

張莉等［20］建立了分析甲苯磺酸拉帕替尼中痕量基因毒性雜質(zhì)4-（3-氟苯甲氧基）-3-氯苯胺（為合成甲苯磺酸拉帕替尼起始原料的中間體，也是其降解產(chǎn)物）的HPLC-MS法，方法檢測(cè)限為0.036 ng/mg，定量限為0.107 ng/mg，可滿足雜質(zhì)測(cè)定的要求。王秀珍等［21］則采用LC-MS/MS法檢測(cè)該遺傳毒性雜質(zhì)，方法的定量限為0.01 ng/mg、檢測(cè)限為0.004 ng/mg，供試品溶液采用四氫呋喃配制，室溫條件下8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

王珊珊等［22］采用HPLC-MS/MS法分析吉非替尼中痕量基因毒性雜質(zhì)3，4-二氟苯胺和4-氯-3-氟苯胺（均為合成吉非替尼原料的副產(chǎn)物），該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，定量限均為0.5 ng/mg。孫春艷等［23］同法測(cè)定吉非替尼中3-氯-4-氟苯胺、3，4-二氟苯胺、3-氟-4-氯苯胺和3，4-二氯苯胺4種基因毒性雜質(zhì)，該方法在特異性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和耐用性方面得到了驗(yàn)證。4種雜質(zhì)的定量限均在0.12～1.2μg/g之間。

宋凡等［24］采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定酒石酸伐尼克蘭中6個(gè)具有潛在基因毒性類苯胺雜質(zhì)的含量。由于類苯胺化合物極易氧化降解，研究采用二巰基蘇糖醇為抗氧化穩(wěn)定劑，并用1%氨水調(diào)pH至7.0，提高了供試品溶液的穩(wěn)定性。該方法專屬性好，靈敏度高，選擇性強(qiáng)，定量限約為1 ng/mg，符合測(cè)定靈敏度要求。

梁鍵謀等［25］建立了測(cè)定富馬酸喹硫平中合成原料N，N-二甲基苯胺含量的LC-MS/MS法，定量限為0.02 ng/mg，低于限度（0.06 ng/mg）。REDDY等［26］建立了檢測(cè)雷貝拉唑中苯二胺、4-硝基二甲基吡啶-N-氧化物和芐基三乙基氯化銨這3個(gè)具有基因毒性前體化合物的LC-MS法。該方法具有良好的線性范圍、特異性、準(zhǔn)確性、精確度和穩(wěn)定性，定量限均低于1.8μg/g，符合測(cè)定靈敏度要求。冼芷然等［27］采用LC-MS/MS法檢測(cè)利多卡因原料和注射液中2，6-二甲基苯胺和潛在遺傳毒性雜質(zhì)N-氯乙酰-2，6-二甲基苯胺，并指出這2個(gè)雜質(zhì)除由原料引入外，可能分別由氧化或堿性條件下降解引入，為鹽酸利多卡因注射液的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和工藝優(yōu)化提供了參考與指導(dǎo)。王慶鵬等［28］建立了測(cè)定替格瑞洛中基因毒性雜質(zhì)N，N-二乙基苯胺含量的LC-MS/MS法，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，檢測(cè)限為0.06 ng/mL，定量限為0.2 ng/mL。

3 總結(jié)與展望

藥品中的雜質(zhì)通常被定義為“影響藥物純度的物質(zhì)”，按其來源可分為工藝雜質(zhì)（合成起始物、中間體、試劑、溶劑、副產(chǎn)物等）和降解雜質(zhì)［29］。藥品中的雜質(zhì)一般無(wú)治療作用，可能有副作用，甚至具有毒性。其中基因毒性雜質(zhì)可直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生基因突變或誘變，或?qū)е掳┌Y，其特殊性引起人們的廣泛關(guān)注［30］。近年來歐洲藥物評(píng)審組織（EMEA）、美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）、國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）等機(jī)構(gòu)或組織相繼發(fā)布了針對(duì)基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則［31-33］，這些原則將“警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和潛在基因毒性雜質(zhì)的標(biāo)志；對(duì)于含有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行（定量）構(gòu)-效關(guān)系評(píng)估和體內(nèi)外基因突變研究，或?qū)㈦s質(zhì)水平控制在毒理學(xué)關(guān)注閾之下。警示結(jié)構(gòu)是指與致突變性相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)或分子（亞）結(jié)構(gòu)，雖然具有警示結(jié)構(gòu)的化合物不一定具有遺傳毒性或致癌性，但提供了遺傳毒性存在的可能性，為藥物研發(fā)和藥物安全評(píng)價(jià)提供了指導(dǎo)。

近年來，藥品監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)愈發(fā)重視藥物中的基因毒性雜質(zhì)，由于該類雜質(zhì)相對(duì)主成分屬痕量物質(zhì)，方法的靈敏度和專屬性尤為重要。GC法靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析速度快，適用于對(duì)熱穩(wěn)定且具有揮發(fā)性的苯胺類化合物。LC法準(zhǔn)確度和精密度較高，適用范圍廣，但普通的C18柱對(duì)某些結(jié)構(gòu)極類似的化合物分離效果較差，可采用特殊的填料如苯基柱、五氟苯基柱彌補(bǔ)分離效能的不足。HPLC-FLD法相對(duì)HPLCUV法有更高的靈敏度和良好的選擇性，適用于可發(fā)射熒光或衍生化后能發(fā)射熒光的物質(zhì)。GC-MS法和HPLC-MS法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可有效降低基質(zhì)干擾，避免假陽(yáng)性，已逐漸成為主流檢測(cè)方法。

目前，大多數(shù)苯胺類雜質(zhì)的檢驗(yàn)方法均采用溶劑溶解樣品后直接進(jìn)樣，主成分和輔料等基質(zhì)的存在對(duì)色譜系統(tǒng)損害嚴(yán)重，影響了方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。因此，建立合適的前處理方法，在除去基質(zhì)的同時(shí)富集被測(cè)物，是苯胺類雜質(zhì)研究的發(fā)展方向。目前已有分散液液微萃取法、固相萃取法［34-35］等前處理方法成功運(yùn)用于藥物雜質(zhì)的檢測(cè)中。本文中重點(diǎn)介紹了藥品中苯胺類基因毒性雜質(zhì)的分析方法，隨著新的檢測(cè)技術(shù)和分析儀器的出現(xiàn)，未來該類雜質(zhì)的分析方法必將向?qū)傩愿鼜?qiáng)、靈敏度更高、準(zhǔn)確度更好的方向發(fā)展。