植物乳桿菌WUH3細(xì)菌素合成基因分析及其特性研究

郭麗丹，何文倩，李洪彪，林一，沙沈菲，汪立平,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海海洋大學(xué), 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，上海，201306)

乳酸菌是目前使用最廣泛的益生菌，它可以合成多種有益物質(zhì)，如細(xì)菌素、胞外多糖等[1]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)作為一種乳酸菌，主要存在于發(fā)酵食品及動物腸道中，具有調(diào)節(jié)代謝、維持菌群平衡、提高人體免疫力等功能，是極具研究價值的一種益生菌。研究表明，L.plantarum不僅被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域，而且它在飼料生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有著不可替代的作用[2-4]。乳酸菌合成的細(xì)菌素是其自身的一種次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)DRIDER等提出的細(xì)菌素遺傳和生化特點(diǎn)分類方案，該細(xì)菌素屬于Ⅱb類，與Plantaricin EF、Plantaricin JK相同，可抑制單增李斯特菌或2種肽合成新的肽[5-6]。乳酸菌細(xì)菌素?zé)o毒副作用，可被蛋白水解酶分解，能夠維持腸道菌群的穩(wěn)定，具備作為抗生素使用的價值[7]。

近年來，隨著L.plantarum基因組測序研究的快速發(fā)展，截至2022年3月，在NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)可以查詢到671株L.plantarum的全基因組序列[8]。通過全基因組序列分析可以得到微生物的基因信息及其安全性，因此全基因組分析越來越受到重視，并被推薦成為菌株鑒定和安全性評估過程的一部分[9]，已有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的研究，例如：TENEAN等[10]通過對L.plantarumUTNGt2進(jìn)行全基因組測序分析，表明其可產(chǎn)生多種細(xì)菌素，具有較強(qiáng)的抑菌能力和良好的安全性，是一種非常有潛力的菌株，可作為細(xì)菌素的潛在生產(chǎn)菌株；BARBOSA等[11]通過全基因組測序評估了產(chǎn)細(xì)菌素的L.plantarumR23菌株的安全性，并分析了其生產(chǎn)的細(xì)菌素的作用方式和在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性，確定了其潛在的應(yīng)用價值。

本研究首先對L.plantarumWUH3進(jìn)行了全基因組測序分析，以了解其細(xì)菌素的合成能力，以及所合成的細(xì)菌素的種類和性質(zhì)。然后，一系列的試驗(yàn)被設(shè)計用于驗(yàn)證基因分析得到的結(jié)果，并確定該菌株的應(yīng)用價值。最后，我們對該菌株的安全性進(jìn)行了分析，以確定其是否會對人體造成危害。該研究有助于促進(jìn)乳酸菌細(xì)菌素的開發(fā)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

植物乳桿菌WUH3(L.plantarumWUH3)，從中國傳統(tǒng)腌制黃瓜中分離得到，保藏于上海海洋大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

主要指示菌：枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilisstrain B39)，分離自鎮(zhèn)沅松子地綠色食品有限公司的脹袋泡菜樣品，其他指示菌菌株見表1。

表1 指示菌菌株Table 1 Indicator strain

培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基(乳酸菌)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基(其他細(xì)菌)、YPD培養(yǎng)基(真菌)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 試劑和儀器

蛋白酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒、透析袋，索萊寶生物科技有限公司；其他試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司。SW-CJ-1F型潔凈工作臺，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；H2050R冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DKY-II恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床，上海社科自動化設(shè)備有限公司；FE28 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化與培養(yǎng)

L.plantarumWUH3在37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，多次劃線純化后，挑取單菌落至MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取菌液離心后，收集1.5～2.0 g菌體至1.5 mL無菌凍存管中，用于DNA提取。

1.2.2 基因組DNA提取與測序

采用MP磁珠法，對提取后的DNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定，保證DNA質(zhì)量≥10 μg，質(zhì)量濃度≥50 ng/μL，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥1.0，無雜質(zhì)污染和基因組嚴(yán)重降解。樣本使用干冰進(jìn)行保存，并寄送到檢測機(jī)構(gòu)(上海美吉生物有限公司)進(jìn)行全基因組測序。

1.2.3 基因組裝

對使用Illumina Hiseq×10得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到有效數(shù)據(jù)；使用SOAP denovo 2.04對基因組進(jìn)行組裝，并利用GapCloser (Version 1.12)對初步組裝結(jié)果進(jìn)行g(shù)ap區(qū)域的填補(bǔ)與優(yōu)化，從而得到最終的組裝結(jié)果[12]。

1.2.4 基因預(yù)測與功能注釋

利用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫對組裝后的基因組進(jìn)行分析，所用軟件和數(shù)據(jù)庫的信息見表2。

表2 軟件和數(shù)據(jù)庫列表Table 2 Software and database list

1.2.5 細(xì)菌素性質(zhì)分析

1.2.5.1 耐受性分析

細(xì)菌素提取：使用乙酸乙酯對除菌發(fā)酵上清液離心(8 000 r/min，4 ℃，15 min)，以得到細(xì)菌素粗提取物。2種溶液首先按體積比1∶1混合，然后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，最后用5 mmol/L PBS(pH=6)重懸，獲得L.plantarumWUH3細(xì)菌素粗提物溶液[13]。

酶耐受性檢測[14]：首先，分別向細(xì)菌素粗提物溶液中加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白酶(堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶溶液，調(diào)節(jié)pH至各酶的最適pH；然后，37 ℃恒溫水浴4 h，再100 ℃加熱使酶失活；最后，調(diào)節(jié)溶液pH至6，用指示菌檢測細(xì)菌素的活性。

溫度耐受性檢測[15]：將細(xì)菌素粗提物溶液分別在-20、0、20、40、60、80、100、121 ℃下處理30 min后，用指示菌檢測細(xì)菌素的活性。

pH耐受性檢測[16]：使用緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)菌素粗提物溶液pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，用指示菌檢測細(xì)菌素的活性。所用緩沖液包括glycine-HCl(pH 2)，citrate-phosphate(pH 3～6)，sodium-phosphate(pH 7)，Tris-HCl(pH 8和pH 9)，glycine-NaOH(pH 10和pH 11)[17]。

上述實(shí)驗(yàn)均以未經(jīng)處理的細(xì)菌素粗提取物作為對照，所有的試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5.2 分子質(zhì)量測定

采用Tricine-SDS-PAGE測定細(xì)菌素粗提物的分子質(zhì)量[18]。首先將電泳凝膠分為兩半，一半用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，并與蛋白Marker對比，觀察肽帶的位置；另一半用無菌去離子水清洗干凈，將其鋪在接有枯草芽孢桿菌(1×106CFU/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h后，將其與染色的另一半凝膠作對比，通過原位抑菌結(jié)果來確定細(xì)菌素分子質(zhì)量。

1.2.5.3 吸附性分析

為了研究細(xì)菌素的吸附特征，首先，將L.plantarumWUH3在37 ℃培養(yǎng)24 h，沸水浴30 min殺死菌體，用1.0 mol/L NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.5，室溫下攪拌30 min，使細(xì)菌素最大程度地吸附到菌體上。然后，離心(8 000 r/min，30 min，4 ℃)收獲菌體，使用100 mL 5 mmol/L PBS緩沖液(pH 6.5)對收獲的菌體進(jìn)行洗滌，將洗滌后的菌體重新懸浮在40 mL 100 mmol/L NaCl溶液中(pH 2.0)，在4 ℃下攪拌12 h，使細(xì)菌素解離。最后，離心(10 000 r/min，30 min，4 ℃)回收細(xì)菌素粗提取物，用0.22 μm微孔濾膜過濾，透析48 h，得到最終產(chǎn)品。用指示菌測試細(xì)菌素活性[18]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.4 抑菌譜的測定

以多種食品腐敗菌和病原菌為指示菌，用雙層瓊脂擴(kuò)散法測定細(xì)菌素粗提物的抑菌效果。所用指示菌濃度為1×106CFU/mL，抑菌板在4 ℃擴(kuò)散2 h后，測量抑菌圈直徑(mm)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

通過二倍梯度稀釋法測定細(xì)菌素的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)[19]。首先，收集枯草芽孢桿菌對數(shù)期的懸濁液(OD=0.4～0.6)，通過添加提純的細(xì)菌素獲得濃度為1×MIC和3×MIC的處理液，靜置3 h，使用無菌PBS為對照。然后在4 ℃下，用2.5%戊二醛固定菌體形態(tài)，接著用無菌PBS緩沖液洗滌菌體，并用乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%，體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行梯度脫水，每個梯度靜置10 min。最后，離心(8 000 r/min，5 min)除去乙醇獲得處理后的菌體，然后用500 μL無水乙醇對得到的菌體進(jìn)行分散，并吸取10～20 μL溶液均勻涂布到潔凈的蓋玻片上，干燥并鍍金后使用S-4800 SEM(日立，日本)成像。依據(jù)TANG等[20]描述的方法觀察并記錄菌體結(jié)構(gòu)表面的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組概況

采用SOAP denovo軟件對L.plantarumWUH3的基因組進(jìn)行組裝，組裝結(jié)果如圖1所示?；蚪M預(yù)測共得到3 378個編碼基因，總長度2 840 538 bp，占基因組的83.52%，詳細(xì)的基因組預(yù)測結(jié)果見表3。

圖1 L.plantarum WUH3基因組圈圖Fig.1 Genome circle of L.plantarum WUH3注：最外面一圈為基因組大小的標(biāo)識；第2圈和第3圈為正鏈、負(fù)鏈上的CDS，不同的顏色表示編碼蛋白序列(CDS)不同的COG的功能分類；第4圈為rRNA和tRNA；第5圈為GC含量；最內(nèi)一圈為GC-Skew值

表3 L.plantarum WUH3基因組統(tǒng)計Table 3 Genome summary of L.plantarum WUH3

2.2 基因功能注釋

細(xì)菌素是一種具有抗菌活性的多肽，屬于次級代謝產(chǎn)物。它的合成途徑與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸運(yùn)輸與代謝、次生代謝物的生物合成等密切相關(guān)[21]。

分別使用GO、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫對L.plantarumWUH3基因組進(jìn)行注釋[22]。如圖2所示,根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果可知，該菌株具有合成多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力，包括跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等；根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果可知，該菌株擁有184條代謝通路，其跨膜運(yùn)輸通路主要集中在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成，其翻譯通路主要集中在核糖體(51個)和氨酰tRNA的合成(28個)，其新陳代謝通路主要集中在次級代謝物(228個)和氨基酸的合成(100個)；根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果可知，該菌株擁有氨基酸運(yùn)輸與代謝相關(guān)基因(208個)和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因(147個)。上述結(jié)果表明，L.plantarumWUH3可能具有細(xì)菌素的合生與分泌能力，具備作為產(chǎn)細(xì)菌素菌株的潛在能力。

a-COG功能分類；b-GO功能分類圖；c-KEGG功能分類圖圖2 L. plantarum WUH3基因注釋圖Fig.2 Gene annotation map of L. plantarum WUH3

2.3 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

利用BAGEL4數(shù)據(jù)庫對基因測序結(jié)果進(jìn)行基因簇分析，以探明其合成細(xì)菌素的種類及相關(guān)基因的位置。結(jié)果顯示L.plantarumWUH3有3個熱點(diǎn)區(qū)域，推測其可合成Plantaricin_EF、Pediocin和Enterocin_X_chain_beta共3種細(xì)菌素(表4)。

表4 L.plantarum WUH3細(xì)菌素合成基因分析Table 4 Bacteriocin synthesis gene analysis of L.plantarum WUH3

2.3.1 Plantaricin_EF基因簇

Plantaricin_EF基因簇的具體信息如圖3所示。其共有15個ORF，啟動子在orf00003之前，orf00003基因片段具有細(xì)菌素合成相關(guān)組氨酸激酶的基因，Plantaricin_EF基因在Scaffold44的0～13 863堿基之間，該基因簇合成的細(xì)菌素屬于含有雙甘氨酸先導(dǎo)肽的細(xì)菌素Ⅱ類的乳球菌素家族，匹配度100%。

圖3 L.plantarum WUH3的Plantaricin_EF基因簇Fig.3 Plantaricin_EF gene cluster of L.plantarum WUH3

2.3.2 Pediocin基因簇

Pediocin基因簇的具體信息如圖4所示。Pediocin基因簇共有9個ORF，啟動子在orf00003之前，其合成的細(xì)菌素屬于片球菌素，匹配度75.248%。

圖4 L.plantarum WUH3的Pediocin基因簇Fig.4 Pediocin gene cluster of L.plantarum WUH3

2.3.3 Enterocin_X_chain_beta基因簇

Enterocin_X_chain_beta基因簇的具體信息如圖5所示。Enterocin_X_chain_beta基因簇共有16個ORF，啟動子有4個，分別在orf00017～orf00019、orf00022-Enterocin_X_chain_beta、orf00025-orf00028、Plantaricin_K之后，核心肽為Enterocin_X_chain_beta和Plantaricin_K，其合成的細(xì)菌素屬于乳球菌素，匹配度53.191%。

圖5 L.plantarum WUH3的 Enterocin_X_chain_beta 基因簇Fig.5 Enterocin_X_chain_beta gene cluster of L.plantarum WUH3

2.4 細(xì)菌素性質(zhì)分析

2.4.1 耐受性

以枯草芽孢桿菌為指示菌研究細(xì)菌素的耐受性。由表5可知，該細(xì)菌素對脂肪酶、淀粉酶及大多數(shù)蛋白酶具有耐受性，但可被胰蛋白酶和中性蛋白酶分解，證明該細(xì)菌素為蛋白質(zhì)。由圖6-a可知，隨著溫度的升高，細(xì)菌素抑菌活性變化不大，甚至在121 ℃時仍具有抑菌活性，這是由于細(xì)菌素具有高度疏水區(qū)域、穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，因而往往具有良好的耐溫性[23]。由圖6-b可知，該細(xì)菌素具有良好的酸堿穩(wěn)定性，能夠在pH 2～11內(nèi)保持抑菌活性。以上結(jié)果表明，該細(xì)菌素可被人體降解，且具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，因而具有巨大的潛在應(yīng)用價值。

表5 細(xì)菌素酶敏感性測試結(jié)果Table 5 Enzyme sensitive test results of bacteriocin

a-溫度;b-pH圖6 穩(wěn)定性測試結(jié)果Fig.6 Stability test results注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4.2 分子質(zhì)量

使用Tricine-SDS-PAGE測定細(xì)菌素的分子質(zhì)量，通過將染色的凝膠與枯草芽孢桿菌重疊來顯示細(xì)菌素的抗菌活性。如圖7所示，在染色的凝膠中有一條4.1～6.5 kDa的單一條帶，且原位抑菌實(shí)驗(yàn)顯示僅該條帶對枯草芽孢桿菌具有抑菌活性。據(jù)此判斷，該細(xì)菌素的分子質(zhì)量在4.1～6.5 kDa。

2.4.3 吸附性

對細(xì)菌素進(jìn)行吸附性研究，研究結(jié)果表明離心后的細(xì)菌素粗提物中檢測不到抑菌活性，而未經(jīng)處理的上清液檢測到了全部的抑菌活性(圖8)，說明細(xì)菌素對宿主細(xì)胞不具有吸附效應(yīng)，后續(xù)不能采用pH吸附-解析法進(jìn)行該細(xì)菌素的分離純化。

M-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-經(jīng)染色的樣品蛋白分子條帶；2-在B. subtilis strain B39平板上的抑菌活性條帶圖7 細(xì)菌素的Tricine-SDS-PAGE電泳Fig.7 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis results of bacteriocin

WUH3-菌株發(fā)酵液；CFS-無細(xì)胞上清液；pH吸附-吸附性實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌素粗提物圖8 細(xì)菌素在細(xì)胞表面的吸附性研究Fig.8 Study on the adsorption of bacteriocin on cell surface

2.4.4 抑菌譜

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法測定細(xì)菌素對多種常見食品腐敗菌和病原體的抑制效果，如表6所示。該細(xì)菌素對多種常見腐敗菌均有抑制效果，這表明其具有廣譜抑菌性。且該細(xì)菌素對于多種食品腐敗和水產(chǎn)病原菌均有良好的抑制效果，這是多數(shù)已報道的細(xì)菌素所不具備的，因此，該細(xì)菌素可作為生物防腐劑，在食品工業(yè)具有很大的應(yīng)用潛力。

2.4.5 微觀結(jié)構(gòu)

使用二倍稀釋法測得該細(xì)菌素的MIC為16 μg/mL。由圖9可知，未經(jīng)處理的枯草芽孢桿菌具有光滑、飽滿、完整的桿狀形態(tài)；經(jīng)細(xì)菌素處理后，其形態(tài)發(fā)生明顯變化，在1×MIC處理時，細(xì)胞表面出現(xiàn)皺紋，細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷。3×MIC處理時，細(xì)胞裂解，產(chǎn)生孔洞，內(nèi)容物流出。上述結(jié)果表明，該細(xì)菌素可直接作用于枯草芽孢桿菌的細(xì)胞膜，引起其細(xì)胞膜破裂，從而實(shí)現(xiàn)殺菌。

表6 L. plantarum WUH3所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜Table 6 Antibacterial spectrum of bacteriocin produced by L. plantarum WUH3

A,D-對照;B,E-1×MIC;C,F-3×MIC圖9 枯草芽孢桿菌的細(xì)胞形態(tài)Fig.9 The cell morphology of B.subtilis strain

2.5 菌株安全性分析

使用VFDB數(shù)據(jù)庫對毒力基因進(jìn)行檢測，得到毒力基因數(shù)目較多的是鐵吸收系統(tǒng)、抗吞噬作用和黏附作用。此外，L.plantarumWUH3還含有一部分幫助細(xì)菌逃離宿主免疫系統(tǒng)的毒力因子，如防止吞噬、激發(fā)炎癥、抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用等；同時還含有對細(xì)胞有抑制作用的溶細(xì)胞素和α溶血素。

使用CARD數(shù)據(jù)庫對耐藥基因進(jìn)行檢測，得到160個抗生素耐藥基因，共編碼了30大類抗生素。其中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥基因最多，其次是四環(huán)素類抗生素耐藥基因。結(jié)合COG注釋分析結(jié)果，可推測該菌株可能對四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生抗性。

使用PHI數(shù)據(jù)庫對致病基因進(jìn)行檢測，共注釋得到649個與病原菌宿主互作相關(guān)的基因，其中，使菌株致病性增加的基因數(shù)量較少，可降低菌株致病性的基因占比較大，并且其含有的大多數(shù)蛋白保證了L.plantarumWUH3不具有致病性。此外，使用Pathogen Finder網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器預(yù)測該菌株的致病性，結(jié)果顯示該菌株不包含任何致病因子，成為人類病原體的的可能性很低(0.213)。因此，L.plantarumWUH3菌株不會對人體產(chǎn)生危害，可被應(yīng)用于食品防腐領(lǐng)域。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對從中國傳統(tǒng)腌制黃瓜中分離得到的乳酸菌——L.plantarumWUH3(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號：JAKUCW 000000000)進(jìn)行了研究和分析。首先，從基因?qū)用孀C明了L.plantarumWUH3具有細(xì)菌素的合成分泌能力，并對可能的編碼細(xì)菌素的基因簇進(jìn)行了檢測和分析。然后，進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明該菌株具有細(xì)菌素的合成分泌能力，其能夠合成蛋白質(zhì)類細(xì)菌素，分子質(zhì)量為4.1～6.5 kDa，可被多種胃腸道蛋白酶分解。進(jìn)一步的分析表明，該細(xì)菌素對多種食源性致病菌均有抑制作用，具備廣譜抑菌性。對菌株進(jìn)行安全性分析表明該菌株對人體無害。綜上所述，L.plantarumWUH3菌株具有良好的抑菌性能和安全性，且其細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，因而有望應(yīng)用于巴氏殺菌食品和熱加工食品中，其在食品防腐領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究對天然防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的參考，有助于L.plantarumWUH3的開發(fā)和應(yīng)用。