枯草芽孢桿菌細菌素A32的抑菌機理研究

高娟娟，賈麗艷*，暢盼盼，田宇敏，甄曉君，王恬恬

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷 030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷 030801）

在食品加工、運輸、貯藏過程中經(jīng)常會受到微生物的污染，使食品腐爛變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。目前，防止食品的腐敗變質(zhì)常用的方法是添加化學(xué)防腐劑[2]，然而，使用化學(xué)防腐劑存在影響人類健康的隱患。開發(fā)綠色、安全、高效的天然防腐劑成為人們關(guān)注的熱點[3]。近年來，細菌素作為綠色生物防腐劑的研究較多[4-5]，特別是對乳酸菌所產(chǎn)細菌素的理論和應(yīng)用研究。然而，乳酸菌產(chǎn)細菌素的抑菌譜較窄，主要是抑制革蘭氏陽性菌，這限制了其的廣泛應(yīng)用[6]。為此，開發(fā)廣譜細菌素成為亟待解決的問題。

枯草芽孢桿菌細菌素A32（簡稱細菌素A32）是本課題組由從山西老陳醋新鮮醋醅中分離篩選的枯草芽孢桿菌HJD.A32 發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌蛋白[7-8]，可通過酸沉淀法獲得[9]。細菌素A32 具有廣譜的抑菌性，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用，對溫度、pH 值、表面活性劑等均具有一定的耐受性，對胰蛋白酶、胃蛋白酶等具有敏感性[8]，具有一定的食用安全性，對人體不會造成危害，適合應(yīng)用于不同食品加工中。研究細菌素A32的抑菌機理，可為該細菌素作為綠色生物防腐劑的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料及試劑

枯草芽孢桿菌HJD.A32（Bacillus subtilis），分離自山西老陳醋新鮮醋醅，保藏于中科院微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC6624；大腸桿菌（Escherichia coli）CGMCC44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CGMCC26003，中國普通微生物菌種保藏管理中心。發(fā)酵液培養(yǎng)基[10]：葡萄糖1 g，酵母浸膏1 g，蒸餾水100 mL。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[11]：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，pH 7.2～7.4。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基[11]：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.2～7.4。

過氧化氫酶，北京solarbio 公司；堿式磷酸酶，南京建成生物工程研究所；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge5417 R 高速冷凍離心機、Centrifuge5804 R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；GZX-GF101-3-BS-Π/H 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD 凈化工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZWYR-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智成分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌素A32 的制備 將培養(yǎng)48 h 的枯草芽孢桿菌HJD.A32 菌液400 r/min 離心10 min，獲取上清液。用6 mol/L 鹽酸，調(diào)節(jié)pH 值至2.0，4℃，靜置24 h；4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，收集沉淀；真空冷凍干燥，條件為：冷肼溫度-35～-40℃，板溫25 ℃，真空度30～40 Pa。待干燥后，-20℃條件下保藏，備用。

1.3.2 細菌素A32 對指示菌的抑菌性及MIC 濃度測定 采用雙層牛津杯法[9]及二倍倍比稀釋法[12]。用0.2 mol/L（pH 5.7）的磷酸緩沖液溶解細菌素A32，配制質(zhì)量濃度分別為80，40，20，10，5 mg/mL 的細菌素溶液。取200 μL 溶液，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，做抑菌試驗，觀察抑菌效果，確定其對指示菌的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.3 指示菌菌懸液的制備 將對數(shù)生長期大腸桿菌和金黃色葡萄球菌采用倍比稀釋法稀釋，獲得菌體濃度為106CFU/mL 指示菌菌懸液。

1.3.4 指示菌生長曲線的測定 將0.2 mL 不同質(zhì)量濃度的細菌素A32 加入指示菌菌懸液中，130 r/min，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h 測定OD600nm值，連續(xù)測定24 h。以未經(jīng)細菌素處理菌懸液作為對照。以時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制生長曲線[13]。

1.3.5 可溶性總糖含量的測定 采用蒽酮法[14]。以未經(jīng)細菌素處理的菌懸液的上清液為對照。

1.3.6 磷含量的測定 向指示菌菌懸液中加入5 mL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的葡萄糖溶液和1 mL 質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的磷標準溶液，分別加入不同質(zhì)量濃度細菌素A32 0.5 mL，充分搖勻后置于37 ℃，130 r/min 培養(yǎng)0，2，4，6，8，10，12 h 后，取出1 mL 于離心管，加入5 mL 三氯乙酸-硫酸亞鐵，靜置10 min，4 000 r/min，5 min，取上清液于試管中，加0.5 mL 鉬酸銨溶液處理后，30 ℃恒溫水浴15 min，冷卻后在630 nm 波長處測吸光值[15]。以未經(jīng)細菌素處理的菌懸液的上清液為對照。

1.3.7 菌體形態(tài)的測定 參考Wang 等[16]的方法。

1.3.8 細胞膜滲透性的測定 將0.2 mL 不同質(zhì)量濃度的細菌素A32 加入到指示菌菌懸液中，130 r/min，37 ℃分別培養(yǎng)0，2，4，6，8，10，12 h 后，取4 mL 菌懸液，4 000 r/min 離心10 min；取上清液，測定OD260nm值。以未經(jīng)細菌素處理的菌懸液的上清液為對照。

1.3.9 細胞膜通透性的測定 采用電導(dǎo)率法[17]，以未經(jīng)細菌素處理的菌懸液的上清液為對照。

1.3.10 細胞膜完整性的測定 采用考馬斯亮藍法[18]。

1.3.11 AKP 含量的測定 將0.2 mL 不同質(zhì)量濃度的細菌素A32 加入到指示菌菌懸液中，130 r/min，37 ℃處理0，2，4，6，8，10，12 h，取菌懸液，4 000 r/min 離心10 min，用堿性磷酸酶試劑盒方法測定上清液AKP 的含量[19]。以未經(jīng)細菌素處理的菌懸液的上清液為對照。

1.3.12 蛋白質(zhì)SDS-PAGE 檢測 將質(zhì)量濃度為80 mg/mL 細菌素1 mL 加入到指示菌菌懸液中，130 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h。4 ℃，12 000 r/min，3K 超濾管離心，收集沉淀，并懸浮于1 mL 無菌蒸餾水中。按體積比1∶2 加入樣品緩存溶液，混勻后用沸水浴煮沸5 min，取20 μL，在15%的分離膠和5%的濃縮膠，穩(wěn)定電壓150 V 的條件下進行SDSPAGE 電泳[20]。利用BIO-RAD 凝膠成像儀得到圖像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌素A32 的抑菌性及MIC

對通過酸沉淀獲得的細菌素A32 進行抑菌性及MIC 測定。結(jié)果見圖1、表1。pH 2 的鹽酸溶液能夠?qū)⒓毦爻恋硐聛?，相同質(zhì)量濃度的細菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌性優(yōu)于對大腸桿菌的抑菌性；在細菌素的質(zhì)量濃度為80 mg/mL 時，抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑可分別達到（15.13±0.14）mm，（17.87±0.11）mm；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL 時，抑菌圈消失，表明細菌素A32 的MIC 為1.25 mg/mL。

圖1 酸沉淀法提取的細菌素A32 的抑菌活性Fig.1 The inhibitory activities of A32 getting by acid precipitation method

2.2 細菌素A32 對指示菌生長曲線的影響

在適宜的生長條件下，菌體生長會出現(xiàn)4 個階段：延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。由圖2可知，與對照組相比，隨著細菌素A32 質(zhì)量濃度的升高，OD600nm值逐漸降低，指示菌生長延緩期逐漸延長，各生長階段也隨之推后。以上結(jié)果表明，經(jīng)不同質(zhì)量濃度細菌素A32 處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，生長繁殖均受到不同程度的抑制，且隨著細菌素質(zhì)量濃度的升高，生長繁殖受到的影響加劇。

圖2 細菌素A32 對指示菌生長曲線的影響Fig.2 Effect of bacteriocin A32 on growth curve of bacteria

2.3 細菌素A32 對指示菌懸浮液中可溶性總糖含量的影響

糖類是細菌生長主要的碳源和能量來源。細菌處于正常的生理狀態(tài)時，會利用環(huán)境中的糖類物質(zhì)，供菌體生長繁殖，當(dāng)膜結(jié)構(gòu)被破壞時，細胞內(nèi)糖類物質(zhì)外泄，導(dǎo)致環(huán)境中糖類物質(zhì)升高。通過指示菌菌懸液中總糖含量的變化，可間接反映細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[21]。由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，空白對照溶液可溶性總糖含量幾乎不變。經(jīng)不同質(zhì)量濃度細菌素A32 處理0～4 h，指示菌菌懸液中可溶性總糖含量逐漸升高，表明指示菌的細胞膜通透性發(fā)生了改變，細胞內(nèi)糖類物質(zhì)外滲。4 h 后可溶性總糖含量均有不同程度下降，說明細菌又開始增殖，利用培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)。以上結(jié)果表明細菌素A32 對大腸桿菌和葡萄球菌膜結(jié)構(gòu)均具有一定的破壞性。

圖3 細菌素A32 對指示菌菌懸液中可溶性總糖含量的影響Fig.3 Effects of bacteriocin A32 on soluble total sugar content of the bacteria

2.4 細菌素A32 對指示菌磷代謝的影響

磷是微生物體內(nèi)核酸、磷脂及糖代謝中間產(chǎn)物的重要組成成分，在細胞的能量代謝中起重要作用。通過測定微生物細胞代謝活動時磷的消耗情況，能夠反映微生物細胞的整體代謝功能及其生長情況[22-23]。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，空白對照組的磷含量呈明顯下降趨勢，表明指示菌消耗了培養(yǎng)液中所添加的磷，對磷進行正常的代謝活動。加入細菌素A32，指示菌中的磷消耗量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低，磷含量變化趨勢相對變緩，表明指示菌磷消耗受到了影響，微生物代謝和生長受到影響。

圖4 細菌素A32 對指示菌總磷含量的影響Fig.4 Effect of bacteriocin A32 on total phosphorus content of bacteria

2.5 細菌素A32 對指示菌細胞結(jié)構(gòu)的影響

由圖5A 可知，培養(yǎng)12 h，未經(jīng)細菌素A32 處理的大腸桿菌菌體外部光滑，細胞形態(tài)完好，細胞之間界限清晰。經(jīng)10 mg/mL 的細菌素A32 處理后，大腸桿菌表面變得粗糙，有孔洞形成；當(dāng)質(zhì)量濃度升高到20 mg/mL 時，菌體細胞嚴重破裂，不具備完整的細胞形態(tài)，有明顯的孔洞。由圖5B 可知，培養(yǎng)12 h，未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌胞體呈立體球狀且飽滿，細胞表面完整、光滑；經(jīng)10 mg/mL 的細菌素A32 處理后，金黃色葡萄球菌菌體表面凹凸不平，出現(xiàn)了少量的溶出物，當(dāng)質(zhì)量濃度升高到20 mg/mL，菌體變形嚴重，有明顯的孔洞。表明細菌素A32 能夠破壞革蘭氏陰、陽性細菌的被膜系統(tǒng)，可導(dǎo)致細菌形態(tài)改變，細胞內(nèi)容物外流。

圖5 細菌素A32 對指示菌結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of bacteriocin A32 on the structure of bacteria

2.6 細菌素A32 對指示菌細胞膜滲透性的影響

細胞膜可以防止外源物質(zhì)進入，也可以阻止菌體內(nèi)部物質(zhì)流出[24]，當(dāng)細菌細胞膜受到損傷后，細胞內(nèi)的小分子物質(zhì)首先滲透到細胞外，然后是核酸等大分子物質(zhì)向外滲出[25]。溶液中核酸的含量常被作為評價細胞膜完整性的指標[26]。由圖6可知，對照組指示菌OD260nm值隨著時間的推移，沒有明顯變化，說明對照組沒有細胞內(nèi)容物質(zhì)溢出；經(jīng)不同質(zhì)量濃度細菌素A32 處理，指示菌菌懸液隨著時間的延長，OD260nm值逐漸升高，說明細菌素A32 導(dǎo)致了指示菌細胞內(nèi)大分子物質(zhì)流出，影響細胞的正常生長，從而抑制了指示菌的繁殖；隨著細菌素濃度的增加，對指示菌的影響增大。比較相同濃度的細菌素A32 處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌懸液的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄菌中OD260nm值變化大于在大腸桿菌中的變化，表明細菌素A32 對金黃色葡萄球菌菌懸液的破壞高于大腸桿菌菌懸液。

圖6 細菌素A32 對指示菌細胞膜滲透性的影響Fig.6 Effect of bacteriocin A32 on the permeability of the cell membrane of the bacteria

2.7 細菌素A32 對指示菌細胞膜完整性的影響

由圖7可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的細菌素A32處理指示菌菌懸液，可溶性蛋白含量變化趨勢相同。處理0～2 h，可溶性蛋白含量有較大幅度的降低，2～6 h 可溶性蛋白含量增加，6 h 后可溶性蛋白含量基本保持不變。說明細菌素A32 可以改變大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的通透性，使蛋白質(zhì)滲透到膜外。隨著細菌素A32 質(zhì)量濃度的增大，可溶性蛋白也隨之增大，說明濃度越高，對細胞膜的破壞性越大。

圖7 細菌素A32 對指示菌細胞膜滲透性的影響Fig.7 Effect of bacteriocin A32 on the permeability of the cell membrane of the bacteria

2.8 細菌素A32 對指示菌細胞膜通透性的影響

細胞膜是細菌的一層保護屏障，當(dāng)強抑制劑破壞細胞膜時，細菌的保護屏障被打破，使其內(nèi)部的電解質(zhì)，如鉀離子等滲透到了細胞外的培養(yǎng)液中，使其培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升，電解質(zhì)外滲導(dǎo)致細胞內(nèi)多種代謝途徑受阻，影響菌體的生長[2]。不同質(zhì)量濃度的細菌素A32 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞膜的通透性均有一定的影響。由圖8可知，加入細菌素A32，培養(yǎng)0～1 h 后，指示菌溶液的電導(dǎo)率顯著增大，說明細菌素A32 在1 h 內(nèi)的抑菌作用明顯。隨著細菌素A32 質(zhì)量濃度的增大，電導(dǎo)率也隨之增大，說明細菌素濃度越高，對細胞膜的破壞性越大。造成以上原因可能是由于細菌素作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后，使細菌細胞膜遭到破壞，通透性增大，細胞內(nèi)Na+、K+等電解質(zhì)外滲到培養(yǎng)液中，使菌液電導(dǎo)率增加。在相同處理時間測定電導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率均明顯高于空白對照組，且金黃色葡萄球菌菌懸液的電導(dǎo)率值大于大腸桿菌菌懸液，表明細菌素A32 對金黃色葡萄球菌菌懸液細胞膜通透性的破壞高于大腸桿菌菌懸液。

圖8 細菌素A32 對指示菌細胞膜通透性的影響Fig.8 Effects of bacteriocin A32 on cell membrane permeability of the bacteria

2.9 細菌素A32 對指示菌細胞壁的影響

指示菌菌液中AKP 的含量變化可反應(yīng)指示菌細胞壁的損傷情況[27]。由圖9可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的細菌A32 處理后，與對照組相比，指示菌上清液中AKP 的含量均有所增加，并且隨著質(zhì)量濃度的增加而增大；大腸桿菌菌懸液經(jīng)細菌素A32處理0～10 h 內(nèi)，AKP 含量逐漸增加，10 h 后，AKP含量保持穩(wěn)定；金黃色葡萄球菌菌懸液經(jīng)細菌素處理0～8 h 內(nèi)，AKP 含量逐漸增加，8 h 后，AKP 含量保持穩(wěn)定；細菌素A32 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響不同，當(dāng)?shù)攘考毦靥幚碇甘揪鷷r，金黃色葡萄球菌的菌懸液中AKP 的含量大于大腸桿菌菌懸液中的含量，表明細菌素A32 對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的細胞壁的影響強于對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的影響。其原因可能與2種菌在細胞壁結(jié)構(gòu)組成上的差異有關(guān)[28]。

圖9 細菌素A32 對指示菌細胞壁的影響Fig.9 Effects of bacteriocin A32 on the cell wall of the bacteria

2.10 細菌素A32 對指示菌蛋白質(zhì)合成的影響

由圖10可知，與對照組相比，經(jīng)質(zhì)量濃度80 mg/mL 細菌素A32 處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)電泳條帶只剩下幾條清晰的條帶，其余條帶顏色較淺或沒有。表明質(zhì)量濃度為80 mg/mL 的細菌素A32 處理指示菌會影響細菌蛋白質(zhì)的合成，推測細菌素導(dǎo)致指示菌菌體細胞膜破裂，菌體內(nèi)容物發(fā)生泄露，從而抑制了菌體蛋白質(zhì)的正常表達。

圖10 細菌素A32 對指示菌蛋白質(zhì)合成的影響Fig.10 Effects of bacteriocin A32 on protein synthesis of bacteria

3 結(jié)論

結(jié)果表明，細菌素A32 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌性，MIC 為1.25 mg/mL；細菌素A32 可以使得指示菌生物量下降，對指示菌的生長曲線具有一定影響；隨著細菌素質(zhì)量濃度的升高，指示菌延緩期逐漸向后推遲；細菌素A32 能使指示菌菌懸液中可溶性總糖含量升高，指示菌無法進行正常的磷代謝，細胞壁和細胞膜受損、表面破裂、內(nèi)容物外泄；使得指示菌蛋白質(zhì)表達受到影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)缺失或含量下降。推測細菌素A32 對大腸桿菌和葡萄球菌的抑菌機制均主要體現(xiàn)在細菌素通過在敏感菌的細胞膜上形成孔洞，使細胞內(nèi)容物外泄，細胞內(nèi)代謝受到影響。本研究將為細菌素A32 作為綠色、天然生物防腐劑應(yīng)用于食品防腐保鮮中提供理論依據(jù)。