傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌選育

劉彩云，麻和平，張文齊，王 潔，彭章普，邵建寧*

（1.甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省科學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

乳酸菌是世界上公認安全的食品級微生物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域[1]。乳酸菌能抑制食品中腐敗菌的生長繁殖，抑菌物質(zhì)主要是其代謝產(chǎn)物如細菌素、過氧化氫、有機酸等[2-4]。其中細菌素是乳酸菌代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的具有殺菌作用的多肽類物質(zhì)，具有安全、高效、無抗藥性、無殘留等優(yōu)點[5-8]。由于細菌素具有潛在的可作為食品生物防腐劑的開發(fā)前景，因此成為生物防腐劑研究領(lǐng)域中的研究熱點[9-11]。乳酸鏈球菌素（Nisin）是目前已商品化且被用于食品防腐的細菌素[12]，但由于乳酸鏈球菌素的抑菌譜較窄，其應(yīng)用受到了一定的限制[13-15]，因此選育產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌菌株對乳酸菌細菌素的研究開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。

瓊脂擴散法操作簡單易行、結(jié)果直觀準確可靠，是抑菌試驗的經(jīng)典方法，被廣泛應(yīng)用于抗生素效價測定以及抑菌物質(zhì)的廣譜抑菌性能檢測[16-18]。但是，傳統(tǒng)瓊脂擴散法在進行抑菌試驗時，每個培養(yǎng)皿中僅能檢測待檢品對一種指示菌的抑菌性能，導(dǎo)致對待檢品進行廣譜抑菌試驗時，檢測工作量大、效率低，因此亟需進行廣譜抑菌試驗方法改進的研究。

本研究以甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中分離純化的96株乳酸菌為研究對象[19]，采用瓊脂擴散法進行了產(chǎn)細菌素乳酸菌篩選[20]，并以篩選的1株產(chǎn)細菌素乳桿菌Lp1為出發(fā)菌株，經(jīng)重離子束12C6+輻照誘變[21-22]，采用培養(yǎng)皿分區(qū)法篩選廣譜抑菌性能優(yōu)于出發(fā)菌株的突變株。本研究采用的培養(yǎng)皿分區(qū)法是作者采用自主設(shè)計制作的培養(yǎng)皿分區(qū)器[23]，在瓊脂擴散法基礎(chǔ)上進行改良的一種廣譜抑菌試驗方法，以期為產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌高效篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

乳酸菌：96株乳酸菌分離自甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品采集樣品。

指示菌：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004、沙門氏菌（Salmonella）ATCC14028、志賀氏菌（Shigella）CICC10865、克羅諾桿菌（Cronobacter）ATCC29544，由甘肅省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基、M17瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；素瓊脂培養(yǎng)基：1 g瓊脂粉溶于100 mL蒸餾水中。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多集團；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；LDZF-75L-II立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DG-1多功能培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械修造廠；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（中國）有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子數(shù)顯卡尺-II型：哈爾濱量具刃具集團有限責(zé)任公司；牛津杯：上海兢翀電子科技發(fā)展有限公司；一次性使用培養(yǎng)皿：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；6區(qū)分區(qū)器（分區(qū)圈直徑85mm，高度8 mm，6個分區(qū)板）：自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌培養(yǎng)上清液制備

將受試乳酸菌菌株按5%接種量，接入盛有10 mL MRS或M17肉湯培養(yǎng)基的試管中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，立即做抑菌檢測或4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 含指示菌營養(yǎng)瓊脂制備

大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、克羅諾桿菌按5%接種量分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h。抑菌檢測時，指示菌培養(yǎng)菌液按照1%的添加量加入50 ℃左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，50 ℃保溫待用，營養(yǎng)瓊脂中指示菌活菌數(shù)保持在106～107CFU/mL。

1.3.3 抑菌試驗

瓊脂擴散法：在無菌培養(yǎng)皿中先加入10 mL滅菌后冷卻至50 ℃左右的素瓊脂培養(yǎng)基，平鋪于皿底中，置于水平臺面上待其自然凝固，作為底層；垂直均勻放置無菌牛津杯3個，再加入10 mL含指示菌營養(yǎng)瓊脂，均勻平鋪于底層之上，作為菌層。待菌層完全凝固后取出牛津杯，在形成的3個瓊脂孔洞中分別入100 μL乳酸菌培養(yǎng)上清液，將培養(yǎng)皿水平正置，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后，觀察有無抑菌圈出現(xiàn)，以抑菌圈直徑大小表示乳酸菌菌株抑制指示菌能力的強弱。

培養(yǎng)皿分區(qū)法：在無菌培養(yǎng)皿中先放入培養(yǎng)皿分區(qū)器的分區(qū)圈，再加入滅菌后冷卻至50 ℃左右的素瓊脂培養(yǎng)基，平鋪于皿底中，置于水平臺面上待其自然凝固，作為底層；在分區(qū)圈中心放入牛津杯后，在培養(yǎng)皿的各個分區(qū)中分別加入1 mL含指示菌營養(yǎng)瓊脂，平鋪于培養(yǎng)皿分區(qū)底層上，待培養(yǎng)皿各個分區(qū)中含不同指示菌營養(yǎng)瓊脂完全凝固后，取出牛津杯，在形成的中心瓊脂孔洞中加入100 μL乳酸菌培養(yǎng)上清液，將培養(yǎng)皿水平正置，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后，采用電子數(shù)顯卡尺測量各個分區(qū)出現(xiàn)的抑菌扇環(huán)的半徑，抑菌扇環(huán)半徑為從中心瓊脂孔洞邊緣到指示菌生長邊緣的徑向長度，以抑菌扇環(huán)半徑大小表示產(chǎn)細菌素乳酸菌株抑制指示菌能力的強弱。

1.3.4 產(chǎn)細菌素乳酸菌篩選

（1）瓊脂擴散法篩選菌株

將受試乳酸菌菌株培養(yǎng)上清液，分別以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，篩選出對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌性能的乳酸菌菌株。

（2）有機酸和過氧化氫排除試驗

將初篩乳酸菌菌株培養(yǎng)上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至5.0，排除有機酸干擾；再在80 ℃條件下加熱10 min，排除過氧化氫干擾[24]；上清液再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，分別以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，篩選出對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌有較好抑菌效果的乳酸菌菌株。

（3）蛋白酶敏感試驗

將復(fù)篩乳酸菌菌株培養(yǎng)上清液分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K在各自作用的最適pH值下處理，各種酶的最終質(zhì)量濃度為1 g/L，37 ℃水浴3 h后，再調(diào)回pH值5.0，以原培養(yǎng)上清液為對照，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，比較抑菌圈直徑變化，判斷復(fù)篩乳酸菌培養(yǎng)上清液對蛋白酶敏感性[25]。

1.3.5 產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌誘變育種

將出發(fā)菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，在無菌條件下，將1.5 mL待輻照菌懸液置于35 mm無菌平皿中，利用中科院近物所重離子加速器淺層輻照終端提供的80 MeV/u，劑量率20 Gy/min的12C6+重離子束進行輻照處理，輻照劑量300 Gy[26]。將輻照后的菌懸液10倍系列稀釋后，選擇適宜稀釋度的稀釋液涂布平板，在MRS瓊脂平板37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24～48 h，挑選所有單菌落，分別接入盛有10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基的試管中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后，收集上清液（見1.3.1），以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌和克羅諾桿菌為指示菌采用培養(yǎng)皿分區(qū)法進行抑菌試驗，測量抑菌扇環(huán)半徑，選出對上述6種指示菌均大于出發(fā)菌株抑菌扇環(huán)半徑的突變株。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019軟件進行整理和分析，結(jié)果用“平均值±標準偏差”表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細菌素乳酸菌篩選

將甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品采集樣品中分離得到的革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性96株乳酸菌菌株，桿菌轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基試管中，球菌轉(zhuǎn)接到M17液體培養(yǎng)基試管中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，采用瓊脂擴散法，以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗，初步篩選出對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌均具有抑制作用的菌株12株，結(jié)果見表1。

表1 篩選的產(chǎn)細菌素乳酸菌的抑菌試驗結(jié)果Table 1 Results of bacteriostatic test on screened bacteriocinproducing lactic acid bacteria

2.2 產(chǎn)細菌素菌株的確定

2.2.1 有機酸和過氧化氫排除試驗

對篩選出的12株菌株培養(yǎng)上清液進行排除有機酸、過氧化氫干擾，再采用瓊脂擴散法，以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗，結(jié)果見表2。由表2可知，排除有機酸、過氧化氫干擾，12株菌株培養(yǎng)上清液對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌2種指示菌均有抑制作用，由此可以說明，篩選出的菌株培養(yǎng)上清液中有其他抑菌物質(zhì)對指示菌起抑制作用。菌株Lp1抑菌效果最好，因此選擇該菌株作進一步研究，菌株Lp1對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果見圖1，其培養(yǎng)上清液對2種指示菌均產(chǎn)生了清晰的抑菌圈。

圖1 菌株Lp1上清液對大腸埃希氏菌（A）及金黃色葡萄球菌（B）的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of strain Lp1 supernatant on Escherichia coli(A) and Staphylococcus aureus (B)

表2 經(jīng)過排除試驗的12株菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌試驗結(jié)果Table 2 Results of bacteriostatic test on Staphylococcus aureus and Escherichia coli of 12 strains after exclusion test

2.2.2 蛋白酶敏感試驗

菌株Lp1培養(yǎng)上清液排除有機酸和過氧化氫干擾后，經(jīng)1 g/L的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K分別處理，其抑菌結(jié)果見表3。由表3可知，經(jīng)胰蛋白酶處理后菌株對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌指示菌的抑菌圈直徑均減小，抑菌能力出現(xiàn)降低趨勢，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性全部喪失，說明抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感，結(jié)合有機酸和過氧化氫排除試驗，可以確定菌株Lp1培養(yǎng)上清液中主要抑菌活性物質(zhì)為細菌素類物質(zhì)。

表3 菌株Lp1的蛋白酶敏感性試驗Table 3 Protease sensitivity tests of strain LP1

2.3 產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌誘變育種

將菌株Lp1作為出發(fā)菌株，應(yīng)用重離子束輻照微生物育種技術(shù)，選育產(chǎn)廣譜產(chǎn)細菌素乳酸菌。對重離子束12C6+300 Gy劑量輻照菌株Lp1誘變得到98株突變菌株，采用培養(yǎng)皿分區(qū)法測定這些菌株對6種指示菌的抑菌性能，篩選出5株突變株L088、L087、L063、L049、L010對6種指示菌的抑菌效果都優(yōu)于出發(fā)菌株Lp1，5株突變菌株與出發(fā)菌株Lp1對6種指示菌抑菌效果見圖2，抑菌扇環(huán)半徑測定結(jié)果見表4。

圖2 培養(yǎng)皿分區(qū)法突變菌株與出發(fā)菌株廣譜抑菌效果Fig.2 Broad-spectrum antibacterial effect of mutant and original strains by Petri dish partitioning method

表4 廣譜抑菌突變株抑菌試驗結(jié)果Table 4 Antibacterial tests results of broad-spectrum antimicrobial mutants

由圖2可知，圍繞平皿中心瓊脂孔洞各分區(qū)都產(chǎn)生了大小不一的抑菌扇環(huán)，菌株L088、L087、L063、L049、L010對6種指示菌的抑菌扇環(huán)半徑均大于出發(fā)菌株Lp1對6種指示菌的抑菌扇環(huán)半徑。由表4可知，篩選的5株廣譜抑菌乳酸菌對6種指示菌的抑制作用均優(yōu)于出發(fā)菌株Lp1，其中，對大腸埃希氏菌抑菌性能提高了11.20%～54.27%，金黃色葡萄球菌提高了8.04%～33.28%，單核細胞增生李斯特氏菌提高了14.48%～25.76%，沙門氏菌提高了11.54%～57.92%，志賀氏菌提高了7.80%～21.39%，克羅諾桿菌提高了15.56%～42.13%。其中，菌株L088對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、克羅諾桿菌6種指示菌的抑菌扇環(huán)半徑比出發(fā)菌株Lp1抑菌扇環(huán)半徑分別提高了47.81%、33.28%、22.97%、45.25%、21.39%、40.21%；L063對6種指示菌的抑菌扇環(huán)半徑比出發(fā)菌株Lp1抑菌扇環(huán)半徑分別提高了54.27%、29.18%、25.37%、58.03%、17.85%、42.13%，因此菌株L088和L063為廣譜抑菌性能較好菌株。

2.4 抑制特定指示菌性能優(yōu)良突變株篩選

采用培養(yǎng)皿分區(qū)法對重離子束輻照Lp1菌株的98株突變菌株進行廣譜抑菌試驗時，發(fā)現(xiàn)有些突變菌株針對6種指示菌中某一種指示菌有良好的抑菌性能，與出發(fā)菌株Lp1的抑菌能力相比有明顯提高，從98株突變菌株中篩選出了分別對6種指示菌抑菌效果最強的5株菌株，試驗結(jié)果見表5。

表5 抑制特定指示菌突變株抑菌試驗結(jié)果Table 5 Antibacterial tests results for specific indicator bacterial mutant strains

由表5可知，與出發(fā)菌株Lp1相比，菌株L092對大腸埃希氏菌抑菌扇環(huán)半徑提高了60.58%，菌株L084對金黃色葡萄球菌抑菌扇環(huán)半徑提高了50.53%，菌株L043對李斯特氏菌和沙門氏菌的抑菌扇環(huán)半徑分別提高了53.78%和42.44%，菌株L002對志賀氏菌抑菌扇環(huán)半徑提高了148.32%，菌株L072 對克羅諾桿菌抑菌扇環(huán)半徑提高了67.47%。

3 結(jié)論

本研究先采用瓊脂擴散法對甘肅牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中分離純化的96株乳酸菌進行了產(chǎn)細菌素菌株篩選，在排除有機酸、過氧化氫干擾和蛋白酶敏感性試驗后，初步判斷篩選的菌株Lp1培養(yǎng)上清液中有細菌素類抑菌物質(zhì)。采用培養(yǎng)皿分區(qū)法，對篩選出的菌株Lp1重離子束12C6+輻照誘變后獲得的98株突變菌株，進行了6種指示菌廣譜抑菌性能比選，選育出對6種指示菌的抑制性能均明顯優(yōu)于出發(fā)菌株Lp1的5株突變菌株，其中L088、L063在5株廣譜抑菌突變菌株中具有較好的廣譜抑菌性。相較于傳統(tǒng)瓊脂擴散法，培養(yǎng)皿分區(qū)法通過在培養(yǎng)皿各分區(qū)中加入不同指示菌，可以比較在相同條件下對不同指示菌的抑菌性能，抑菌扇環(huán)半徑大小可以直觀反映對不同指示菌抑菌能力，在1個培養(yǎng)皿中可同時完成檢測6種指示菌的抑菌試驗，可用于產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌高效篩選。