功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

孫秋婉，洪厚勝，2*

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇 南京 210009）

紅曲霉（Monascus）是一種小型絲狀腐生真菌，將其接種在大米上進(jìn)行發(fā)酵，可將大米轉(zhuǎn)化為紅曲米[1]。紅曲米作為發(fā)酵食品和民間醫(yī)藥已有數(shù)千年的歷史[2]，用于治療脾胃不和[3-4]、消化不良[5-6]、腹瀉促進(jìn)血液循環(huán)等[7]；也可用于釀造食醋和酒[8-9]；紡織品[10]、化妝品或藥品的染色[11]。紅曲米中含有多種活性成分，如莫納克林K（Monacolin K，MK）、色素[12]和γ-氨基丁酸等[13]。MK是一種白色晶體，是紅曲米中的活性成分之一。1979年，日本遠(yuǎn)藤章教授首次從紅曲霉發(fā)酵液中分離出能抑制膽固醇合成的活性物質(zhì)，命名為MK[14]。MK為白色結(jié)晶狀粉末，不溶于水、微溶于甲醇，在乙醇、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑中溶解度較高。MK呈現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)，即內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)和酸式結(jié)構(gòu)[15]。在堿性條件下，內(nèi)酯式可轉(zhuǎn)化為酸式結(jié)構(gòu)。

莫納克林K也被稱為洛伐他汀（lovastatin，LOV），是一種從紅曲霉中分離的次級代謝產(chǎn)物。因其結(jié)構(gòu)與3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）相似，故能競爭性的和膽固醇合成途徑中的限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）結(jié)合，從而降低血脂水平，用于治療心腦血管疾病[16]。而市場上降脂藥物的主要成分是內(nèi)酯MK，它是一種前體藥物，服用后必須經(jīng)水解成β-羥基酸形式才有活性[17]。由此，在功能性紅曲米中，酸式MK含量越多應(yīng)用價(jià)值越高。天然發(fā)酵得到的功能性紅曲米中MK絕大部分是酸式結(jié)構(gòu)，可直接發(fā)揮降脂作用[18]。他汀類藥物完全不耐受的高膽固醇血癥患者可服用酸式MK達(dá)到降低血脂的目的[19]。

前體物質(zhì)指能為產(chǎn)物合成提供底物的物質(zhì)。可通過蛋白質(zhì)修飾改變結(jié)構(gòu)，從不具備活力的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫邆涔δ艿某墒祗w，因此，可作為次級代謝產(chǎn)物的指示劑[20]。將前體物質(zhì)加入培養(yǎng)基后，微生物能將其直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中，從而促進(jìn)產(chǎn)物合成[21]。前體物質(zhì)可分為內(nèi)源性前體和外源性前體，內(nèi)源性前體是由微生物自身生長代謝所合成的，因此對于微生物而言具有極好的適應(yīng)性和耐受性，譬如短鏈脂肪酸。外源性前體是人工添加的，濃度過高會對微生物生長產(chǎn)生毒副作用。蛋氨酸可作為前體物質(zhì)，與醋酸鹽合成二氫莫納克林L[22]，同時(shí)改變紅曲霉的滲透性，促進(jìn)MK從細(xì)胞中的分泌[23]，減少M(fèi)K在紅曲霉胞內(nèi)中的含量，從而促進(jìn)MK的合成。研究表明，L-蛋氨酸和腺嘌呤核苷三磷酸可在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶作用下合成S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM），SAM是甲硫鍵型高能化合物，可對細(xì)胞生長、分化和功能產(chǎn)生重要影響[24]。采用流加方式補(bǔ)加前體L-蛋氨酸，流加28 h后SAM最高積累量達(dá)到4.98 g/L，生物量為132 g/L[25]。因此有必要使用L-蛋氨酸作為代謝調(diào)控物質(zhì)優(yōu)化功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化。

本課題選取L-蛋氨酸作為代謝調(diào)控物質(zhì)，采用早秈米為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并附加一定營養(yǎng)物質(zhì)作為發(fā)酵培養(yǎng)基，創(chuàng)新性的在功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵過程的低溫發(fā)酵階段添加L-蛋氨酸，旨在提高酸式MK的產(chǎn)量，為紅曲產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)提供工藝方法和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）CGMCC No.18110：為本實(shí)驗(yàn)室分離菌種，現(xiàn)保藏于本實(shí)驗(yàn)室和中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 試劑

早秈米：市售；洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、L-蛋氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、大豆粉、蛋白胨、麥芽浸粉、七水硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸銨、氫氧化鈉、磷酸氫二甲、乙腈：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨3 g/100 mL，麥芽汁浸粉3 g/100 mL，瓊脂1.5 g/100 mL[26]。以每瓶200 mL培養(yǎng)基分裝至500 mL三角瓶中，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。pH自然。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖6 g/100 mL，蛋白胨2.5 g/100 mL，玉米粉1g/100mL，NaNO30.2g/100 mL，K2HPO40.1g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.1 g/100 mL。以每瓶100 mL種子液分裝至500 mL三角瓶中，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。pH自然。

固態(tài)培養(yǎng)基：稱取干燥的大米50 g，浸泡8 h后，用純凈水清洗至無白漿。瀝干水分，裝入500 mL三角瓶內(nèi)，用塑封膜封口。上鍋蒸制（上汽后蒸煮10 min），0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50S-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器、GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-2FD無菌操作臺：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；1260 Infinity高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；ZQTY-70 臺式全溫振蕩培養(yǎng)：上海知楚儀器有限公司；PYX-DHS-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海恒躍醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉的純化

在超凈工作臺內(nèi)，采用平板劃線法將紅曲霉接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，在30 ℃條件下培養(yǎng)7 d進(jìn)行純化。直到獲取到符合條件的菌株，再將其接種到新的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至紅曲霉長出孢子。

1.3.2 種子培養(yǎng)液的制備

取生長良好的紅曲霉斜面，用接種針挑取紅曲霉接種到盛有100 mL液態(tài)種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，使孢子懸液的濃度為106個(gè)/mL，制得紅曲霉種子液。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵方法

在無菌條件下向固態(tài)培養(yǎng)基中接入紅曲霉種子液15mL，封口后移入培養(yǎng)室發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵包括常溫發(fā)酵和低溫發(fā)酵兩個(gè)階段，先進(jìn)行常溫發(fā)酵，后進(jìn)行低溫發(fā)酵，常溫發(fā)酵階段培養(yǎng)條件為：30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。低溫發(fā)酵階段培養(yǎng)條件為：20 ℃條件下培養(yǎng)21 d。在低溫發(fā)酵第4天，將L-蛋氨酸溶于10 mL無菌水，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min。在無菌條件下加入發(fā)酵基質(zhì)中，繼續(xù)低溫發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束，即可獲得紅曲米產(chǎn)品。

1.3.4 Monacolin K的檢測與計(jì)算

（1）樣品處理

將發(fā)酵完成的紅曲米在50 ℃條件下烘干（大概8 h），粉碎，過40目篩，稱取0.04 g于10 mL比色管中，量取體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，定容體積為4 mL。在55 ℃條件下水浴1 h，每20 min搖勻一次，完成后取萃取液，使用0.22 μm濾膜過濾。

（2）高效液相色譜條件

檢測波長：238 nm；流動(dòng)相：水∶乙腈=45∶55（V/V），用磷酸調(diào)pH為2.5；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，加入50 ℃的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液90 mL，再用20%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.7，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容至100 mL，50 ℃條件下水浴30 min后得到200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液，再按比例稀釋得到0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm濾膜過濾后高效液相色譜儀上樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以酸式洛伐他汀含量為橫坐標(biāo)（X）作圖，得出洛伐他汀含量-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過作圖軟件分析處理得到回歸線性方程：Y=8 996.157 2X-7 162.587 8，決定系數(shù)R2=0.999 9。

（4）紅曲樣本中酸式Monacolin K含量計(jì)算公式

式中：A0為酸式MK峰面積；C0為酸式標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，μg/mL；A為酸式標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；4為樣品體積，mL；0.04為紅曲米質(zhì)量，g。

1.3.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）單因素試驗(yàn)

基礎(chǔ)試驗(yàn)條件：稱取干燥的大米100 g，浸泡8 h后，用純凈水清洗至無白漿，裝入500 mL錐形瓶中，蒸熟滅菌后分別接種15%的種子培養(yǎng)液，于30 ℃下培養(yǎng)3 d促進(jìn)菌絲體生長，20 ℃下培養(yǎng)21 d后測定MK含量。

改變單一變量，考察不同發(fā)酵時(shí)間（16 d、18 d、20 d、22 d、24 d、26 d）、不同接種量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）、不同種類氮源（2.0%的大豆粉、蛋白胨、麥芽浸粉、硝酸鈉、硫酸銨）、最佳氮源添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、不同種類碳源（2.5%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油）、最佳碳源添加量（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）、L-蛋氨酸添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、L-蛋氨酸添加時(shí)間（低溫發(fā)酵的0、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）對酸式MK產(chǎn)量的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

為進(jìn)一步研究變量之間交互作用的影響關(guān)系，選取對酸式MK產(chǎn)量影響較大的4個(gè)單因素，即大豆粉添加量（A）、甘油添加量（B）、L-蛋氨酸添加量（C）、接種量（D）為評價(jià)因素，酸式MK產(chǎn)量為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

1.3.6 掃描電鏡檢測

將0.10%的L-蛋氨酸添加至麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d，在超凈工作臺上取5 mm×5 mm大小的紅曲霉菌落。將取下來的菌落在4 ℃條件下，用2.5%戊二醛固定液浸泡4 h。而后，使用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗20 min，重復(fù)4次。使用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液將樣本浸泡10 min進(jìn)行逐級脫水，用二氧化碳臨界儀干燥，制成待測樣品后進(jìn)行電鏡掃描。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，采用Origin 2021、Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對紅曲Monacolin K產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時(shí)間對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on acid Monacolin K yield

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，MK含量呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的變化趨勢。在固態(tài)培養(yǎng)第24天，酸式MK產(chǎn)量達(dá)到最大值2.70 mg/g，隨著固態(tài)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)基質(zhì)消耗殆盡，酸式MK的合成速率低于消耗速率。酸式MK產(chǎn)量開始小幅度下降，因此最佳發(fā)酵時(shí)間是24 d。

2.1.2 接種量對Monacolin K產(chǎn)量的影響

接種量對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著接種量的增加，MK含量呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的變化趨勢。當(dāng)接種量為15%時(shí)，酸式MK產(chǎn)量達(dá)到最大值2.95 mg/g。接種量對紅曲合成次級代謝產(chǎn)物MK十分重要，接種量過少時(shí)，菌體生長緩慢，酸式MK產(chǎn)量低，隨著接種量增加，菌體大量繁殖，培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基和氧氣供應(yīng)不足，造成酸式MK產(chǎn)量減少，因此最佳接種量是15%。

圖2 接種量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of inoculum on acid Monacolin K yield

2.1.3 不同種類氮源對Monacolin K產(chǎn)量的影響

不同種類氮源（添加量2.0%）對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，選取大豆粉為氮源時(shí)酸式MK的產(chǎn)量達(dá)到最大值4.36 mg/g，對比硝酸鈉、硫酸銨為氮源時(shí)有了明顯提升。因此選擇大豆粉為紅曲固態(tài)發(fā)酵的氮源。

圖3 不同種類氮源對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on acid Monacolin K yield

2.1.4 大豆粉添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響

大豆粉添加量對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著大豆粉添加量的增加，MK含量呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的變化趨勢。大豆粉添加量較低時(shí)，培養(yǎng)基菌絲體生長較慢。當(dāng)大豆粉添加量為2.0%時(shí)，酸式MK產(chǎn)量達(dá)到最大值4.44 mg/g。大豆粉添加量過高時(shí)，菌絲體生長繁殖過快，營養(yǎng)基質(zhì)消耗過快，因此最佳大豆粉添加量是2.0%。

圖4 大豆粉添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of soybean powder addition on acid Monacolin K yield

2.1.5 不同種類碳源對Monacolin K產(chǎn)量的影響

不同種類碳源（添加量2.5%）對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，選取甘油為碳源時(shí)，酸式MK的產(chǎn)量達(dá)到最大值4.53 mg/g，明顯高于以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖為碳源時(shí)的酸性Monacolin K產(chǎn)量，因此選擇甘油為紅曲固態(tài)發(fā)酵的碳源。

圖5 不同種類碳源對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on acid Monacolin K yield

2.1.6 甘油添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響

甘油添加量對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著甘油添加量的增加，MK含量呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的變化趨勢。當(dāng)甘油添加量為2.5%時(shí)，酸式MK的產(chǎn)量達(dá)到峰值4.55 mg/g。隨著甘油添加量的繼續(xù)增加，酸式MK的產(chǎn)量明顯下降。推測是因?yàn)楦视吞砑恿吭龆嗪?，紅曲霉生長速度增加，而次級代謝產(chǎn)物減少。因此最佳的甘油添加量是2.5%。

圖6 甘油添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of glycerol addition on acid Monacolin K yield

2.1.7L-蛋氨酸添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響

MK是紅曲霉發(fā)酵合成的次級代謝產(chǎn)物，合成途徑為聚酮化合物途徑，其合成機(jī)制研究的很充分[27]。蛋氨酸作為前體物質(zhì)，可與醋酸鹽合成二氫莫納克林L，從而促進(jìn)MK的合成[28]。L-蛋氨酸添加量對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著L-蛋氨酸添加量的增加，MK含量呈現(xiàn)先增加后急速下降再保持平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)L-蛋氨酸添加量為0.10%時(shí)，MK產(chǎn)量達(dá)到最高9.00 mg/g。而當(dāng)L-蛋氨酸添加量為0.20%、0.25%、0.30%，MK產(chǎn)量不再下降，當(dāng)L-蛋氨酸濃度過高時(shí)，SAM合成量增加，細(xì)胞生長速率增加，從而使次級代謝產(chǎn)物合成量減少。因此最佳的L-蛋氨酸添加量為0.10%。

圖7 L-蛋氨酸添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of L-methionine addition on acid Monacolin K yield

2.1.8L-蛋氨酸添加時(shí)間對Monacolin K產(chǎn)量的影響

L-蛋氨酸添加時(shí)間對酸式MK含量的影響結(jié)果見圖8。由圖8可知，隨著L-蛋氨酸添加時(shí)間的延長，MK含量呈現(xiàn)先增加到峰值后急速下降的變化趨勢。L-蛋氨酸添加時(shí)間過早時(shí)，紅曲還未開始大量合成次級代謝產(chǎn)物，故MK產(chǎn)量不高；當(dāng)L-蛋氨酸添加時(shí)間為低溫發(fā)酵96 h時(shí)，酸式MK產(chǎn)量達(dá)到最大值8.88 mg/g。添加過晚又會錯(cuò)過MK大量合成的時(shí)間。因此最佳的L-蛋氨酸添加時(shí)間為低溫發(fā)酵第96小時(shí)。

圖8 L-蛋氨酸添加時(shí)間對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of L-methionine addition time on acid Monacolin K yield

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

以單因素結(jié)果為基礎(chǔ)，選取大豆粉添加量（A）、甘油添加量（B）、L-蛋氨酸添加量（C）、接種量（D）4個(gè)因素為變量，酸式MK產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental for fermentation conditions optimization

利用Design-Expert 軟件對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果如表3所示。對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到酸式MK產(chǎn)量（Y）與大豆粉添加量（A）、甘油添加量（B）、L-蛋氨酸添加量（C）、接種量（D）的二次多項(xiàng)式回歸方程：

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of quadratic regression model

Y=-32.310 42+28.531 67A+4.335B+191.833 33C+1.298D+0.08AB-15.7AC+0.066AD+1.1BC+0.084BD+2.47CD-7.125A2-1.19B2-971C2-0.059 85D2

該模型決定系數(shù)R2=0.971 7，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.943 4，F(xiàn)值=34.34，P＜0.000 1極顯著，失擬項(xiàng)P=0.554 8不顯著。以上數(shù)據(jù)表明，二次項(xiàng)回歸方程擬合性良好，該模型對于L-蛋氨酸促進(jìn)酸式MK合成工藝優(yōu)化具有實(shí)際應(yīng)用意義。由表3分析可知，模型一次項(xiàng)D，交互項(xiàng)CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響均為極顯著（P＜0.01），模型一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AC和BD對結(jié)果影響均為顯著（P＜0.05）。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

各因素交互作用對酸式Monacolin K產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線見圖9。由圖9可知，大豆粉添加量和L-蛋氨酸添加量（AC）、甘油添加量和接種量（BD）交互作用影響顯著（P＜0.05）；L-蛋氨酸添加量和接種量（CD）的響應(yīng)面圖坡度趨勢較陡，等高線趨于橢圓形，表明L-蛋氨酸添加量和接種量交互作用對酸式MK產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），與方差分析結(jié)果一致。

圖9 各因素交互作用對酸式Monacolin K產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on acid Monacolin K yield

2.2.3 回歸模型的驗(yàn)證及試驗(yàn)結(jié)果

通過回歸方程可知，當(dāng)A（大豆粉添加量）=2.32%，B（甘油添加量）=2.51%，C（L-蛋氨酸添加量）=0.10%，D（接種量）=15.99%時(shí)，酸式MK產(chǎn)量出現(xiàn)理論最大值20.69 mg/g。結(jié)合實(shí)際操作情況，設(shè)置試驗(yàn)條件為裝料量1∶5（500 mL三角瓶中裝100g早秈米）、接種量16.0%、大豆粉添加量2.3%、甘油添加量2.5%、L-蛋氨酸添加量0.10%、發(fā)酵時(shí)間24 d（前3d30℃，后21d20℃）、低溫發(fā)酵第4天添加L-蛋氨酸。在此最佳條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，酸式MK的產(chǎn)量分別為20.93 mg/g、20.27 mg/g、21.80 mg/g，平均實(shí)際值為21.00 mg/g，與預(yù)測值相近，說明該模型穩(wěn)定可靠。且產(chǎn)量遠(yuǎn)超QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》規(guī)定的4.0 mg/g，具有極大利用價(jià)值。

2.3 L-蛋氨酸對紅曲霉菌絲體的影響

發(fā)酵基質(zhì)中添加0.1%L-蛋氨酸與未添加L-蛋氨酸的紅曲霉掃描電鏡圖見圖10。

圖10 發(fā)酵基質(zhì)中未添加L-蛋氨酸（A）與添加0.1% L-蛋氨酸（B）的紅曲霉掃描電鏡圖Fig.10 Scanning electron microscopy of Monascus without L-methionine (A) and with 0.1% L-methionine (B) in fermentation substrate

由圖10A可知，在未添加L-蛋氨酸的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，紅曲霉的菌絲存在大量的繁雜分枝、分枝較為光滑、菌絲體之間呈明顯的網(wǎng)結(jié)聯(lián)合。由圖10B可知，添加0.1%L-蛋氨酸的發(fā)酵液，菌絲緊密繁茂、菌絲體長勢粗壯，利于紅曲次級代謝產(chǎn)物的積累[29-30]。同時(shí)，紅曲霉分枝出現(xiàn)較多褶皺，細(xì)胞壁與原生質(zhì)體間的縫隙增大。菌絲體褶皺增多，細(xì)胞膜通透性增加，利于次級代謝產(chǎn)物積累[31-32]。通過掃描電鏡結(jié)果，推測添加0.1%L-蛋氨酸的紅曲霉的菌絲體變粗，細(xì)胞膜通透性增加，從而使細(xì)胞內(nèi)的MK能順利轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，反饋抑制降低，MK產(chǎn)量得以增加。

3 結(jié)論

本研究擬在解決功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝存在的酸式MK產(chǎn)量低的問題。通過單因素試驗(yàn)考察發(fā)酵時(shí)間、接種量、不同種類氮源、不同種類碳源、大豆粉添加量、甘油添加量、L-蛋氨酸添加量、L-蛋氨酸添加時(shí)間對功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵合成酸式MK產(chǎn)量的影響，選取對酸式MK產(chǎn)量影響較為明顯的4個(gè)單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。最終得到功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件為：裝料量100 g/500 mL、甘油2.5%、大豆粉2.3%、前體物質(zhì)L-蛋氨酸0.10%、接種量16.0%。前3 d 30 ℃高溫發(fā)酵，后21 d 20 ℃低溫發(fā)酵，共24 d。在低溫發(fā)酵第4天添加L-蛋氨酸，此條件下經(jīng)3次試驗(yàn)得到的酸式MK產(chǎn)量平均值為21.00 mg/g，與優(yōu)化前的2.95 mg/g比，提高了85.95%，且遠(yuǎn)超QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》規(guī)定的4.0 mg/g，具有極大利用價(jià)值。