不同部位牛肉肌原纖維蛋白乳化特性研究

何悅珊，馬長明，師瑞,3，趙改名，祝超智，原曉喻，余小領*

1(河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002)2(河南麥瑞克食品科技有限公司，河南 鄭州，450018) 3(西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌，712100)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和收入水平的不斷提高，我國居民的肉類消費結構逐步優(yōu)化，牛肉消費量逐年上升[1]，2018年我國牛肉總供給量為747.9萬t，2019年增至764.27萬t，到2020年778.57萬t[2]。牛肉與其他肉類相比營養(yǎng)豐富，膽固醇含量低，蛋白質含量較高，氨基酸的比例更接近人體需求[3]。牛肉制品種類很多，根據(jù)制品工藝特點可分為醬鹵(白煮肉類、糟肉類)、罐藏(硬罐頭、軟罐頭)、調(diào)理(牛肉醬，調(diào)理牛排等)、香腸(中式香腸、熏煮香腸、發(fā)酵香腸、生鮮香腸)、脫水(肉干、肉松、肉脯)、油炸(酥牛肉、牛肉絲)、熏燒烤(燒烤牛肉、熏烤牛肉)、腌臘(咸肉、臘肉、風干肉)8個類型[4]，大部分類型以大塊牛肉為加工原料，而以牛肉糜為原料制作的乳化肉糜類產(chǎn)品較少。乳化肉糜類制品是以脂肪、肌肉和水為主要原料，通過斬拌、罐裝、熟制和冷卻等工藝制成的一種肉制品，借助于該產(chǎn)品類型可以將脂肪充分利用，避免原料浪費，同時也拓寬了我國肉制品的種類[5]。

肌原纖維蛋白是肌肉中的主要蛋白質，占總蛋白的50%～60%，在牛肉蛋白中能達到70%，是乳化肉糜類制品制作過程中不可缺少的主要成分[6]。在乳化肉糜類制品加工過程中，互不相溶的牛脂肪與瘦肉中的水分在肌肉中的肌原纖維蛋白作為乳化劑的作用下，通過斬拌的方式形成了穩(wěn)定的乳化體系[7]，其生產(chǎn)的關鍵在于能夠最大限度地保留水分和原料肉當中附帶的脂肪，而肌原纖維蛋白對保留水和脂肪起到了非常重要的作用，對其乳化特性是非常關鍵的加工特性之一，能夠給予乳化肉糜類制品較為理想的物理化學性質和感官特性[5]。也會對后續(xù)的凝膠制品的質構和保水特征造成直接影響[8]，因而備受關注。對于肌原纖維蛋白的乳化特性的研究大多則集中在豬肉中，對牛肉肌原纖維蛋白的乳化特性研究較少。乳化特性的差異不僅體現(xiàn)在不同種類的肉中，也表現(xiàn)在同種肉的不同部位中。其中肌原纖維蛋白在乳化穩(wěn)定性和乳化活性的不同都是導致乳化特性不同的重要原因[9]。國內(nèi)外對乳化活性的研究主要以乳化活性指數(shù)為參考，涉及肉類蛋白的研究很少[10]。本文擬以生產(chǎn)中最常使用的牛霖肉、牛肩頸肉、牛腩肉為研究對象，通過測定并比較其中肌原纖維蛋白乳化特性的差異，蛋白分子間作用力含量比較，蛋白二級結構的差異以及牛肉勻漿物乳化能力的比較，探討不同取樣部位牛肉肌原纖維蛋白在乳化特性和二級結構方面的差異，以期為乳化牛肉糜類制品原料選擇提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從市場購買巴西進口牛霖肉、牛肩頸肉和牛腩肉，分別分割后裝入保鮮袋，處于0～4 ℃的條件下運輸至實驗室，置于-20 ℃冰柜中保存。

NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、MgCl2、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、β-巰基乙醇、KCl、CuSO4·5H2O、NaKC4H4O6·4H2O、NaOH、尿素(均為分析純)，購于國藥控股化學試劑有限公司(上海)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA)、Triton-100、牛血清蛋白標準品，購于索萊寶科技有限公司(北京)；大豆油，市售金龍魚牌大豆油。

1.2 儀器與設備

AL-104電子分析天平，上海梅特勒-托利多公司；JR17-300絞肉機，蘇泊爾電器公司；35172-BRUZ均質器，法國梅里埃公司；EC-215電導率儀，德國Hanna公司；高速分散器，德國IKA公司；HH.S21-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊有限公司；UV-2600紫外分光光度計，島津企業(yè)有限公司；NEO-1600高速冷凍離心機，香港利康生物醫(yī)療公司；LABRAM HR Evolution激光共聚焦拉曼光譜儀，HORIBA上海茂培科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

將-20 ℃冷凍下的牛霖肉、牛肩頸肉、牛腩肉在4 ℃冷庫中解凍24 h，剔除筋膜后，用絞肉機將肉絞成肉糜。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參照PARK等[11]和夏天蘭[12]的方法做適當修改，取純瘦肉糜50 g，加入4倍體積的分離緩沖液Ⅰ(0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L的EGTA溶解至0.2 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液)，均質180 s，3 000×g、4 ℃離心13 min，取沉淀，此過程重復2次。取沉淀加入4倍體積分離緩沖液Ⅱ(0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1% Triton-100、1 mmol/L EGTA溶解至0.2 mol/L、pH 6.5的磷酸鹽緩沖液)，勻漿1 min，過濾，3 000×g、4 ℃離心13 min，此過程重復1次。沉淀加入4倍分離緩沖液Ⅰ，勻漿1 min，3 000×g、4 ℃離心13 min。取沉淀繼續(xù)加入4倍分離緩沖液Ⅲ(0.1 mol/L NaCl)，勻漿1 min，3 000×g、4 ℃離心13 min，此過程重復3次。此后可直接以同等條件重復離心直至未有溶液離出。用雙縮脲法測定蛋白質量濃度。

1.3.3 肌原纖維蛋白質量濃度測定

用pH 6.5磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋至10 mg/mL左右，蛋白樣品與雙縮脲試劑按照體積比1∶4混合，常溫下反應30 min，在540 nm下測定吸光度。

1.3.4 肌原纖維蛋白乳化活性測定

采用離心法并稍作修改[13]，測定3個部位的肌原纖維蛋白乳化活性。將蛋白稀釋至5 mg/mL，取1 mL蛋白液加入10 mL大豆色拉油、10 mL蒸餾水，高速分散器2檔(10 000 r/min)勻漿1 min，1 300×g、4 ℃離心5 min。乳化活性的計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性測定

采用離心法并稍作修改[14]，測定3個不同部位的肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性。將蛋白稀釋至5 mg/mL，取1 mL蛋白液加入10 mL大豆色拉油、10 mL蒸餾水，高速分散器2檔(10 000 r/min)勻漿1 min。80 ℃水浴30 min，自來水冷卻15 min，1 300×g、離心5 min。乳化穩(wěn)定性的計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.6 肌原纖維蛋白化學作用力測定

參照楊慧娟[15]的方法測定蛋白化學作用力。

1.3.7 肌原纖維蛋白二級結構及含量測定

參照CAO等[16]的方法并加以修改。將樣品均勻涂在載玻片上，使用拉曼光譜儀，用545 nm處的激光進行測量，儀器功率為25 mW。儀器使用單晶硅校準，單晶硅有1個520 nm的發(fā)射峰。使用200 mHz狹縫寬度、600 g/mm的光柵、2 cm-1的分辨率和60 s的積分時間來測量樣品的發(fā)射。樣品在400～4 000 cm-1內(nèi)掃描3次。使光譜平滑化并創(chuàng)建一個平緩的基線，通過歸一化進行二階曲線擬合，得出所需要峰的面積，計算每個結構的百分比。

1.3.8 牛肉乳化能力測定

參照郝婉名等[17]的方法并加以修改，50 g肉糜加入800 mL 0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4溶液，高速分散器6檔(24 000 r/min)勻漿2 min，4 ℃放置24 h后過濾。取16個50 mL離心管均加入15 mL勻漿液，依次加入0～15 mL大豆色拉油，在冰水浴中，高速分散器2檔(10 000 r/min)勻漿10 s，得乳狀液后迅速將其移至已標記10 mL刻度的試管中，測定電導率值，進行3次平行實驗，分別記錄每組數(shù)據(jù)。乳化能力的計算如公式(3)所示：

乳化能力=Aσ

(3)

式中：A為換算系數(shù)，取0.937 5；σ為電導率值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)、相關性分析(Pearson)，P<0.05為差異顯著。每組試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同部位牛肉肌原纖維蛋白質量濃度比較

不同取樣部位牛肉純瘦肉中提取的肌原纖維蛋白質量濃度如表1所示。由表1可知，去除筋膜和脂肪的牛肩頸肉中的肌原纖維蛋白質量濃度最高，牛腩次之，牛霖肉最低。蛋白質量濃度越高，單位體積的分子數(shù)越多，分子間的作用力就更強。WANG等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)，在1～8 mg/mL蛋白質量濃度的范圍內(nèi)，蛋白質量濃度越高，形成的乳液中參與乳化的蛋白分子數(shù)量就越多。為了考察不同部位肌原纖維蛋白自身的乳化特征，消除因蛋白質量濃度差異而造成的影響，本文關于肌原纖維蛋白的其他指標均在同一濃度下測定。

表1 不同樣品部位牛肉肌原纖維蛋白乳化指標測定結果Table 1 Emulsification index of beef myofibrillar protein from different sampling sites

2.2 不同部位牛肉肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

不同取樣部位牛肉肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性如表1所示。由表1可知，牛霖肉和牛肩頸肉的蛋白乳化活性均顯著高于牛腩肉(P<0.05)，牛肩頸肉的蛋白乳化穩(wěn)定性顯著高于牛腩肉(P<0.05)，但與牛霖肉無顯著差異。蛋白乳化活性指單位質量的蛋白質可以穩(wěn)定水油界面的體積，反映了肌原纖維蛋白乳化能力的趨勢[13]。蛋白乳化穩(wěn)定性指蛋白質保持乳化物體系穩(wěn)定的能力[14]。ZORBA等[19]研究發(fā)現(xiàn)同一種動物不同部位肉的肌原纖維蛋白在同一濃度下的乳化活性也存在差異，一方面是因為蛋白質的特異性差異所導致，另一方面是因為肉的蛋白種類特性及成分不同。郝婉名等[17]的研究顯示，西門塔爾雜交牛的牛肩肉的乳化穩(wěn)定性較好，這與本研究結果基本一致。

為了探討蛋白自身特性對其乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響，本研究測定了肌原纖維蛋白的化學作用力和二級結構。

2.3 不同部位牛肉肌原纖維蛋白化學作用力分析

不同取樣部位牛肉肌原纖維蛋白化學作用力如表2所示。由表2可知，不同取樣部位的化學作用力含量均存在顯著性差異(P<0.05)。實驗所測定的蛋白化學作用力中的氫鍵，離子鍵、二硫鍵和疏水相互作用力指的是蛋白分子間的作用力，該作用力的含量越多說明蛋白分子間結合越緊密，蛋白自身越穩(wěn)定，這反而使得蛋白與外界物質的結合作用減弱[20]。乳化是蛋白與外界物質水和油的反應，蛋白與水和油的結合越弱，其乳化特性就越弱[20-21]。結果表明，牛腩肉的肌原纖維蛋白中氫鍵，離子鍵，疏水相互作用及二硫鍵含量最多(P<0.05)，這與其蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最弱是一致的；牛霖肉肌原纖維蛋白的氫鍵，離子鍵，疏水相互作用及二硫鍵含量最低，但其乳化穩(wěn)定性較高。

在蛋白肽鏈主鏈(骨架)中，局部肽段蛋白依靠氫鍵維持的具有周期性的結構構象就是蛋白質二級結構，WALTERS等[22]發(fā)現(xiàn)氫鍵越多，二級結構越穩(wěn)定，維持α-螺旋穩(wěn)定性的主要作用力就是氫鍵。離子鍵雖然不是蛋白質折疊的主要作用力，但對蛋白質的穩(wěn)定性起到了重要作用，其中形成離子鍵的靜電作用在蛋白質折疊中起到了很大的穩(wěn)定作用[21]。疏水相互作用會影響蛋白質的三維結構的構象，有研究發(fā)現(xiàn)疏水相互作用越多，整個蛋白質折疊體系的穩(wěn)定性也會變強[20]。二硫鍵雖不對蛋白結構起到主要作用，但能夠維持蛋白質的熱穩(wěn)定性[21]。

牛肉肌原纖維蛋白乳化特性與化學作用力的相關性分析如表3所示，肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性與離子鍵含量呈正相關，與氫鍵含量，疏水相互作用，二硫鍵含量呈負相關，但均未達到顯著水平；乳化活性與化學作用力呈顯著負相關(**)。肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性和乳化活性呈顯著正相關，相關系數(shù)達到0.489(**)。

表2 不同樣品部位牛肉肌原纖維蛋白化學作用力含量測定結果Table 2 Determination of chemical force content of beef myofibrillar protein from different sampling sites

表3 不同樣品部位牛肉肌原纖維蛋白乳化特性與化學作用力的相關性分析Table 3 Correlation analysis of emulsifying properties and chemical forces of beef myofibrillar protein from different sampling sites

2.4 不同部位牛肉肌原纖維蛋白二級結構及含量分析

不同取樣部位牛肉肌原纖維蛋白拉曼光譜如圖1所示，由圖1可知，3個部位均在酰胺Ⅲ帶區(qū)間1 200～1 300 cm-1內(nèi)出現(xiàn)明顯波峰，此譜帶主要是由α-螺旋結構引起的，在此范圍內(nèi)的相對強度均逐漸上升，在酰胺Ⅰ帶區(qū)間1 600～1 700 cm-1內(nèi)的相對密度急劇下降，且三者下降幅度有差異，此時酰胺Ⅰ中的β-轉角結構和無規(guī)則卷曲結構含量改變明顯[5]。

不同取樣部位二級結構含量如圖2所示，3個部位的蛋白二級結構均存在顯著性差異。無規(guī)則卷曲結構，也稱自由卷曲，是除有規(guī)則的二級結構以外，主鏈骨架的其他未明確的二級結構的蛋白質肽段，大多數(shù)既非隨意卷曲，也非完全無規(guī)。無規(guī)卷曲柔性較大，雖存在一定任意性，但有明確而穩(wěn)定的結構，這類有序的非重復性結構常構成酶的活性部位和其他蛋白質特異的功能部位，同時能夠增大蛋白質的柔韌性[23]，能夠暴露更多的疏水性基團，使得蛋白與外界物質，如油的結合作用加強，從而增強了蛋白的乳化能力，牛肩頸肉無規(guī)則卷曲結構含量最多，其在3個部位中也表現(xiàn)出最好的乳化活性及乳化穩(wěn)定性。β-轉角是蛋白質結構中數(shù)量最多最大的轉角結構，由4個氨基酸的分子內(nèi)氫鍵形成，結構內(nèi)的180°回折能夠穩(wěn)定轉折結構[24]，使得蛋白結構更加穩(wěn)定，與外界物質油和水的結合作用變?nèi)?，本研究中牛腩肉肌原纖維蛋白的α-螺旋結構含量較高，且存在一定含量的β-轉角結構，由此反應出牛腩肉肌原纖維蛋白的乳化特性最差。

圖1 不同樣品部位牛肉肌原纖維蛋白拉曼光譜Fig.1 Raman spectra of beef myofibrillar protein from different sampling sites

圖2 不同樣品部位牛肉肌原纖維蛋白二級結構含量Fig.2 Secondary structure content of myofibrillar protein in beef from different sampling sites

2.5 不同部位牛肉勻漿物乳化能力分析

不同取樣部位牛肉勻漿物乳化能力如圖3所示。由圖3可知，不同取樣部位牛肉勻漿物乳化能力存在顯著性差異(P<0.05)。其中，牛霖肉勻漿物乳化能力最強，雖與牛肩頸肉差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于牛腩肉。這與前文牛霖肉肌原纖維蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均較高的結果是一致的，其原因可能是由于牛霖肉肌原纖維蛋白自身化學作用力整體最弱，故而在加工體系中，其與油、水的結合力可能更強，這與趙改名等[25]對新疆褐牛不同部位勻漿物的乳化能力測定時所發(fā)現(xiàn)的牛霖肉勻漿物乳化能力最強的結果一致。

圖3 不同樣品部位牛肉勻漿物乳化能力Fig.3 Emulsification ability of beef homogenate content at different sampling sites

3 結論

在蛋白質量濃度相同的條件下，由于牛肩頸肉和牛霖肉肌原纖維蛋白的氫鍵含量、離子鍵含量、疏水相互作用、二硫鍵含量低于牛腩肉肌原纖維蛋白，導致牛霖肉和牛肩頸肉肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性和乳化活性較高(P<0.05)，且在牛肉勻漿物乳化能力中也表現(xiàn)出較好的乳化特性。牛肩頸肉肌原纖維蛋白的α-螺旋結構含量低于牛霖肉，無規(guī)則卷曲的含量高于牛霖肉，二級結構的測定反映出牛肩頸肉肌原纖維蛋白的乳化特性較好，但由于牛肩頸部位的筋膜較多，在生產(chǎn)加工中需要花費大量的人力和時間進行處理，牛霖部位的筋膜很少且?guī)缀鯖]有多余脂肪，對于工藝優(yōu)化及規(guī)模化生產(chǎn)更有利。因此，綜合各項指標可知，牛霖肉更適合進行牛肉乳化肉糜類制品的加工，希望本研究結果可以為牛肉乳化肉糜類制品的生產(chǎn)及原料選擇應用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。