調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在燒創(chuàng)傷中的作用研究進(jìn)展

徐佳敏，劉 富，段德慶綜述，張紅艷審校

0 引 言

燒創(chuàng)傷是一種可隨時(shí)隨地發(fā)生卻未被重視的傷害。燒創(chuàng)傷可由摩擦、冷、熱、輻射、化學(xué)物質(zhì)或者電造成，但大多數(shù)的燒傷是由熱液、固體或火引起的[1]。身體在燒傷后產(chǎn)生的一系列反應(yīng)使其具有獨(dú)特性：受傷后，全身和局部的應(yīng)激反應(yīng)會立即觸發(fā)，且難以快速恢復(fù)。嚴(yán)重的燒創(chuàng)傷會引起一種復(fù)雜的反應(yīng)模式，這種反應(yīng)模式可在傷后持續(xù)數(shù)年。通常情況下，身機(jī)體在受到創(chuàng)傷后會立即觸發(fā)炎癥反應(yīng)以促進(jìn)愈合[2]，然而，在嚴(yán)重?zé)齻校装Y進(jìn)程變得漫長且不受控制，這導(dǎo)致炎癥加劇，引起全身分解代謝狀態(tài)和愈合延遲。這種反應(yīng)幾乎是燒創(chuàng)傷獨(dú)有的，且與分解代謝、感染、器官衰竭甚至死亡率的增加有關(guān)[3-4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)作為一類特殊的T淋巴細(xì)胞亞群，對維持機(jī)體免疫動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用。近年來，關(guān)于Treg在燒創(chuàng)傷中的研究日益增多，尤其在膿毒血癥、多器官功能障礙綜合征及創(chuàng)面愈合等方面。盡管在動(dòng)物模型中Treg在燒創(chuàng)傷中作用已逐步得到闡明[5]，然而，這些細(xì)胞在人體燒創(chuàng)傷后的作用研究仍處于起步階段。本文就Treg在燒創(chuàng)傷中的作用研究進(jìn)展及現(xiàn)狀作一綜述，旨在深化對Treg的認(rèn)識，并為燒創(chuàng)傷后的治療干預(yù)開辟新途徑和提供新思路。

1 Treg

若干年前，有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)除了含有自身反應(yīng)性T細(xì)胞之外，還存在能夠抑制由這些細(xì)胞引起的自身免疫的T細(xì)胞，這些抑制細(xì)胞后來被稱之為Treg，CD25被鑒定為該細(xì)胞亞群的第一個(gè)標(biāo)志物[6]。自然產(chǎn)生的CD4+Treg細(xì)胞主要在胸腺(thymus-derived Treg，tTreg)中發(fā)育且依賴于相對較強(qiáng)的T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)信號，這使得Treg細(xì)胞具有豐富的自體抗原識別系統(tǒng)[7]。在外周，Treg可在TGF- β存在時(shí)通過TCR刺激幼稚CD4+Foxp3-T細(xì)胞產(chǎn)生，被稱為外周Treg(peripherally-derived Treg，pTreg)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外，可通過模擬pTreg生成的體內(nèi)條件從CD4+Foxp3-中生成Treg(induced Treg，iTreg)[9-10]。此外，根據(jù)其表面標(biāo)記、產(chǎn)生的細(xì)胞因子和作用機(jī)制的不同，Treg還可分為CD4+CD25+Treg、Tr1和Th3等多種亞型[11]。

叉頭樣/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3)是Treg發(fā)育、增殖和發(fā)揮抑制功能的關(guān)鍵分子，通常被認(rèn)定是CD4+CD25+Treg最有特異性的標(biāo)志[12]。研究表明，Treg功能依賴于小鼠和人類的Foxp3表達(dá)水平。Foxp3參與構(gòu)成TCR誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物并調(diào)節(jié)它們的活性，這被認(rèn)為對于調(diào)節(jié) Treg中TCR誘導(dǎo)基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)至關(guān)重要，因?yàn)檫@構(gòu)成了Treg介導(dǎo)的免疫抑制的主要機(jī)制[8,13]。需要特別注意的是，雖然在小鼠中 Foxp3 的表達(dá)僅限于Treg，但許多人類 Foxp3+T細(xì)胞與常規(guī)T細(xì)胞 (conventional T cell，Tconv) 的相似度比與Treg更高，并且一些激活的非抑制性 Tconv 表達(dá)低水平Foxp3[14]。因此，將 Foxp3 表達(dá)與其他 Treg 標(biāo)記物(CD45RA、CD127(IL-7R)、CD25)結(jié)合起來，以便在人類中識別和分析這些細(xì)胞是至關(guān)重要的[15-16]。

Treg可通過直接作用于效應(yīng)細(xì)胞群或通過調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞 (APC) 表型的間接機(jī)制來發(fā)揮其功能[17]。Jonuleit等[18]發(fā)現(xiàn)，tTreg似乎通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和程序性死亡受體-1(programmed death receptor -1,PD-1)等受體以依賴性接觸的方式對效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和功能發(fā)揮抑制作用。相比之下，pTreg主要通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和白介素-10 (interleukin-10，IL-10)等可溶性因子發(fā)揮其抑制功能[8]。Treg主要通過三種機(jī)制對不同細(xì)胞類型發(fā)揮抑制作用：①產(chǎn)生可溶性因子，如抗炎細(xì)胞因子(IL-10、IL-35 和 TGF-β)、絲聚蛋白-2(filaggrin-2，F(xiàn)LG-2)、腺苷、顆粒酶和穿孔素；②競爭生長因子，Treg上的高親和力CD25 受體與效應(yīng) T 細(xì)胞競爭相關(guān)配體；③抑制性受體，已觀察到 Treg通過 CTLA-4、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3, Tim-3)、神經(jīng)纖毛蛋白-1 (neuropilin-1, NRP-1)、半乳糖凝集素-1 (galectin-1, Gal-1)和淋巴細(xì)胞激活基因-3(lymphocyte-activation gene 3, LAG-3)及其配體的相互作用對靶細(xì)胞有直接作用[19]。

2 Treg在燒創(chuàng)傷中的作用

2.1 Treg與膿毒血癥膿毒癥可造成約50%～60%的燒創(chuàng)傷患者死亡，其主要機(jī)制是免疫系統(tǒng)麻痹或免疫癱瘓。嚴(yán)重?zé)齻腥静l(fā)癥病理過程中, 機(jī)體天然免疫反應(yīng)障礙被認(rèn)為是誘發(fā)膿毒癥的最重要因素之一[20-21]。燒傷后膿毒癥對宿主免疫系統(tǒng)的影響是通過多重機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，包括輔助性T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，CD4+T 淋巴細(xì)胞凋亡增加，Treg凋亡減少及細(xì)胞因子譜改變等。

大量資料表明，并發(fā)膿毒癥或死亡的燒傷患者體內(nèi)Treg活性增加。MacConmara等[22]對小鼠模型的研究表明，燒傷后Treg數(shù)量和活性的上調(diào)與抗原呈遞和Th1反應(yīng)被抑制有關(guān)，之后Treg消耗可使其恢復(fù)。Yamakawa等[23]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷誘導(dǎo)記憶樣 Treg 群體的擴(kuò)張和激活，大量的Treg對創(chuàng)傷反應(yīng)強(qiáng)烈，可能在胸腺或外周組織的發(fā)育過程中獲得了直接對損傷作出反應(yīng)的能力。通過觀察小鼠模型，還發(fā)現(xiàn)DAMPs或特定的MHCII+APC亞群(如B細(xì)胞)可能參與了CD44highTreg的激活。

Tatura等[24]檢查了 Foxp3+Treg 細(xì)胞與濃度血癥早期的相關(guān)性，通過實(shí)驗(yàn)觀察到與未經(jīng)歷Treg耗竭的小鼠相比，F(xiàn)oxp3+Treg的耗竭導(dǎo)致更嚴(yán)重的膿毒血癥病程。這一發(fā)現(xiàn)表明 Treg在盲腸結(jié)扎穿孔模型(cecal ligation and puncture,CLP)膿毒癥的早期階段減弱了過度炎癥免疫反應(yīng)。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在廣泛組織損傷期間釋放的 IL-33 誘導(dǎo)膿毒癥幸存者體內(nèi)巨噬細(xì)胞的 ILC2s 擴(kuò)張和 M2 極化，可促進(jìn)傷口愈合過程。然而，IL-33 誘導(dǎo)分泌 IL-10 的 M2 巨噬細(xì)胞增加了 Treg 細(xì)胞群的擴(kuò)增，從而導(dǎo)致了長期敗血癥誘導(dǎo)的免疫抑制的發(fā)展[25]。最近有研究者發(fā)現(xiàn)，表達(dá)T細(xì)胞Ig和ITIM結(jié)構(gòu)域受體(T-cell immuno-receptor with Ig and ITIM domains，TIGIT)的Foxp3+Treg細(xì)胞在抑制Th1和Th17反應(yīng)中起著核心作用。此外，TIGIT+Treg亞群也可作為Th2適應(yīng)性免疫的誘導(dǎo)劑。Mikhael等[5]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然在膿毒癥的急性期觀察到TIGIT-Treg細(xì)胞的增多，但在膿毒癥的晚期只有TIGIT+Treg擴(kuò)大并保持顯著增加，從而證明了CD4+TIGIT+Treg是在膿毒癥后階段增加的Treg的主要亞群。該實(shí)驗(yàn)也證明了通過IL-33/ST2/STAT6/M2巨噬細(xì)胞對TIGIT+Treg亞群的擴(kuò)增是與膿毒癥免疫抑制狀態(tài)相關(guān)的重要事件。

機(jī)體長期存在的Treg導(dǎo)致嚴(yán)重持續(xù)免疫反應(yīng)和與不良預(yù)后相關(guān)。在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，始終存在著同時(shí)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)亢進(jìn)和免疫功能抑制的雙重因素。一般來說，早期以炎癥反應(yīng)亢進(jìn)為主，中晚期以免疫功能抑制為主，但是這兩者的時(shí)間區(qū)分與界限并不清，而且在整個(gè)過程中都會伴隨著兩者的相互調(diào)節(jié)與拮抗。大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) Treg在膿毒癥中是持續(xù)增高的，這種變化可能是機(jī)體為了逃避過度的炎癥反應(yīng)引發(fā)嚴(yán)重的組織器官損傷的一種自身調(diào)節(jié)反應(yīng)，但存在一定的限度[26]。

2.2Treg與多器官功能障礙綜合征燒創(chuàng)傷患者存在的過度炎癥反應(yīng)與機(jī)體應(yīng)激性炎癥因子過量釋放有關(guān)，并因此形成炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)，持續(xù)存在的過度炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致患者出現(xiàn)免疫功能障礙及血管內(nèi)皮損傷等癥狀，并可能引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，最終導(dǎo)致患者死亡。

由非炎性抗原引起的全身性的免疫反應(yīng)稱為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatary response syndrome，SIRS),目前認(rèn)為SIRS是 MODS 的共同通路，而免疫炎性反應(yīng)失衡是導(dǎo)致 MODS發(fā)生的根本原因。有研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)創(chuàng)傷患者SIRS診斷成立后的24 h內(nèi)，Treg比例即有顯著升高，并且CD4/CD8明顯下降，這提示多發(fā)創(chuàng)傷患者早期SIRS過程中Treg比例就升高，并且這種發(fā)揮抗炎作用的Treg可通過多種途徑抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫紊亂，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖能力低下，CD4/CD8的比例失調(diào)等[27]。

關(guān)于 SIRS/MODS 存在多種動(dòng)物模型，主要是酵母多糖誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)模型(zymosanInducedGeneralInfection，ZIGI)和CLP被廣泛運(yùn)用。ZIGI 模型的病理學(xué)改變在時(shí)間和程度上都和人類無感染的SIRS 很相似，而 CLP 模型和典型的感染患者的 SIRS相似。有研究證實(shí)在 ZIGI模型中Treg產(chǎn)生的抑炎因子IL-10可有效減緩 MODS 的發(fā)展，但 Treg在酵母多糖誘導(dǎo)的 SIRS 模型中的作用仍未闡明[28-29]。此外，研究表明，γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17在SIRS的損傷中產(chǎn)生著重要作用。而γδT細(xì)胞可產(chǎn)生一種熱不穩(wěn)定的小分子物質(zhì)對Treg產(chǎn)生直接抑制作用[30]，因此推測在SIRS模型中γδT細(xì)胞對Treg存在直接抑制作用。

Treg作為CD4+T細(xì)胞的一個(gè)子集，其任務(wù)是控制其他Th細(xì)胞可能造成的潛在損傷作用[31]。其可通過抑制炎癥、使APC失活或阻斷常規(guī)CD4+和CD8+T細(xì)胞的反應(yīng)性來預(yù)防各類炎癥疾病。這些細(xì)胞在促進(jìn)燒創(chuàng)傷后SIRS/MODS中的作用正逐漸被強(qiáng)調(diào)。

2.3Treg與創(chuàng)面愈合Treg的特殊亞群存在于身體的許多外周(即非淋巴)器官中[32]，這些細(xì)胞都是用于減輕過度炎癥反應(yīng)[33]、維持組織穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)器官功能。通常，小鼠和人類皮膚中的 Treg分別占到30-50%和20-30%總CD4+T細(xì)胞[34]。傷口愈合是個(gè)高度炎癥過程，會使得很多循環(huán)免疫細(xì)胞聚集到受傷組織中。Treg在表皮擦傷或全層損傷后在皮膚中積聚，在受傷后約 1 周達(dá)到最大水平[35-36]。當(dāng)皮膚出現(xiàn)傷口時(shí)，某些高表達(dá) CD25、CTLA-4 和共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)的活化Treg 能夠抑制傷口中產(chǎn)生干擾素-γ (interferon-gamma, IFN-γ) 的 T 細(xì)胞和炎性巨噬細(xì)胞。此外，Treg表達(dá)大量表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)有助于其組織修復(fù)能力[35]。研究者證明皮膚調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過趨化因子17(chemoattractant cytokine ligand 17,CCL17) 和 趨化因子22(chemoattractant cytokine ligand 22, CCL22)與其受體即趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CCR4)的相互作用遷移到皮膚，積極修復(fù)皮膚損傷組織。其中，CCL17促進(jìn)血管識別和外展，而CCL22引導(dǎo)隨后的皮膚遷移[37-38]。在皮膚傷口引起炎癥的情況下，當(dāng)炎癥自發(fā)消退，之后任何的抗原表達(dá)都可引起微弱且短暫的免疫反應(yīng)。有進(jìn)一步的研究表明，上述情況的出現(xiàn)是因?yàn)橐恍〔糠諸reg持續(xù)存在于皮膚中，它們表達(dá)低水平的CD25，但表達(dá)較高的 KLRG1、CTLA4和CD127，類似于記憶 T 細(xì)胞[39]。

目前尚不清楚不同來源的Treg之間是否在功能上存在差異?，F(xiàn)已明確，募集到受傷肌肉中的Treg 與內(nèi)臟脂肪組織中的非再循環(huán)組織駐留 Treg 具有許多相同的修復(fù)轉(zhuǎn)錄特征，這表明無論個(gè)體發(fā)育如何，受傷組織中的 Treg 最終均可實(shí)現(xiàn)類似的修復(fù)能力[40-41]。有資料表明，組織浸潤Treg與組織駐留Treg 之間可能存在時(shí)間或空間差異[42]。

對于Treg如何參與創(chuàng)面修復(fù)，有實(shí)驗(yàn)證明EGFR的配體雙調(diào)蛋白 (amphiregulin，AREG) 的分泌是包括 GATA-3+Treg在內(nèi)的許多Ⅱ型免疫細(xì)胞共有的組織修復(fù)的主要機(jī)制[43]。皮膚中的GATA-3+Treg 表達(dá)“警報(bào)素受體”(如 TSLP、IL-33 和可能的 IL-18)，這些受體在組織損傷時(shí)被釋放，使它們能夠感知局部損傷。其中，IL-18 和IL-33可刺激修復(fù)性細(xì)胞因子雙調(diào)蛋白的Treg產(chǎn)生，且與 TCR 刺激無關(guān)。除了賦予Treg直接的組織修復(fù)功能外，部分GATA結(jié)合蛋白3(GATA-binding protein 3, GATA-3)和干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulated factor 4, IRF4)還通過穩(wěn)定Foxp3的表達(dá)來增強(qiáng)適應(yīng)性 Treg 功能，這些“經(jīng)典”Treg功能與 TCR 刺激有關(guān)[42]。

雖然在傷口愈合過程的早期，炎癥對于預(yù)防感染是必要的，但過度的炎癥對傷口愈合會適得其反。在組織修復(fù)的初始階段，Treg通過減弱過度的Ⅲ型免疫反應(yīng)在促進(jìn)正常表皮再生方面發(fā)揮間接作用[36]。最近有研究顯示，皮膚 Treg 在維持穩(wěn)態(tài)和皮膚纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌梢种萍〕衫w維細(xì)胞的活化，表明這些細(xì)胞可通過在傷口愈合后期抑制Ⅱ型免疫來防止過度瘢痕形成[44]。除此之外，Treg分泌的兩種廣泛抗炎和高度多效性的細(xì)胞因子IL-10 和 TGF-β已被證實(shí)廣泛參與傷口愈合[45]。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，Treg在燒創(chuàng)傷中具有重要作用，主要體現(xiàn)在對損傷后皮膚的修復(fù)和免疫功能的調(diào)節(jié)等方面。近年來，Treg在不同領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，研究者對Treg在燒創(chuàng)傷中作用的認(rèn)識取得了不同程度的進(jìn)步，但仍有許多重要科學(xué)問題亟待深入研究。首先，人類Treg的研究因缺乏將Treg與其他 T 細(xì)胞群獨(dú)特地分離的明確表面標(biāo)志物而受到阻礙。小鼠與人類之間存在明顯差異，在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Treg特征是否同樣適用于人類仍需大量的臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。其次，創(chuàng)傷激活Treg是有益還是有害，或者調(diào)節(jié)Treg是否可作為創(chuàng)傷和創(chuàng)傷相關(guān)并發(fā)癥(如機(jī)會性感染、全身炎癥或器官損傷等)的免疫治療尚不清楚。此外，膿毒癥后Treg 細(xì)胞表達(dá)增加的影響一直存在爭議，因?yàn)橐恍┤藢⑵渑c更糟的預(yù)后相關(guān)聯(lián)，而其他人則認(rèn)為其與更好的預(yù)后和免疫力相關(guān)，Treg在燒創(chuàng)傷中作用的機(jī)制尚未得到充分闡明。目前觀察到的IL-33/ST2/STAT6/M2巨噬細(xì)胞對TIGIT+Treg亞群的擴(kuò)增與膿毒癥免疫抑制狀態(tài)相關(guān)有望成為臨床研究Treg的一個(gè)新切入點(diǎn)，進(jìn)一步明確燒創(chuàng)傷后Treg在人體內(nèi)的變化及相關(guān)作用機(jī)制，為燒創(chuàng)傷后的治療和干預(yù)開辟新的途徑。