ISG15及其介導(dǎo)的ISG修飾在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展

彭 錚，龐 驄綜述，李 偉，杭春華審校

0 引 言

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是人體結(jié)構(gòu)的“司令部”，與其他系統(tǒng)相比，神經(jīng)系統(tǒng)解剖復(fù)雜，發(fā)生疾病往往更為兇險，給患者帶來不良預(yù)后。如何理解中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生疾病后的病理生理過程，尋找靶點對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行干預(yù)，也是當(dāng)前的研究熱點。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (protein translational modifications, PTMs) 是指某些功能基團(tuán)或蛋白質(zhì)可以添加至靶蛋白上，對靶蛋白功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而增加蛋白質(zhì)組的功能多樣性，比如磷酸化、泛素化、甲基化、乙?；⒅；⑷樗峄揎椀萚1]，PTMs對細(xì)胞的各種生理病理過程都具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此，識別和理解 PTMs在細(xì)胞生物學(xué)和疾病治療和預(yù)防的研究中至關(guān)重要。干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene15,ISG15)是一個類泛素蛋白，可以發(fā)揮翻譯后修飾作用，雖然泛素化修飾通常導(dǎo)致目標(biāo)蛋白被降解，但與泛素化修飾不同的是，ISG15修飾對蛋白功能的影響更加復(fù)雜多樣。ISG15在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，對其研究也更有助于對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行理解，為疾病的干預(yù)尋找研究思路。

1 ISG15及其介導(dǎo)的ISG修飾

1.1 ISG15的結(jié)構(gòu)ISG15是一個相對分子質(zhì)量為15 000～1 7000的蛋白，于1979年被研究人員發(fā)現(xiàn)[2]，其結(jié)構(gòu)中具有兩個泛素樣結(jié)構(gòu)域[3, 4]，可以與蛋白共價結(jié)合，通過翻譯后修飾發(fā)揮生物學(xué)作用。其C末端具有亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Leucine-Arginine-Leucine-Arginine-Glycine-Glycine, LRLRGG)氨基酸鏈[5]，含有兩個區(qū)域(D1、D2)，D1為N端結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)第3～78個氨基酸，D2為C端結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)第79～154個氨基酸[6]，C端和N端均與泛素有大約33%的同源性，此外ISG15與泛素也具有一定的構(gòu)象相似性[7]。泛素的氨基酸殘基賴氨酸29是ISG15的受體，細(xì)胞內(nèi)可以作為ISG15的底物[8]，這說明ISG15也有可能參與到泛素的生物學(xué)作用中，但是其機制仍不十分清楚。ISG15在多種哺乳動物及魚類等脊椎動物均有表達(dá)，在不同物種甚至同一物種之間有都具有序列差異性，可能與在三級結(jié)構(gòu)上介導(dǎo)不同的功能有關(guān)[9]，然而其LRLRGG氨基酸鏈在不同物種中具有保守性[4]。

1.2ISG修飾ISG15與泛素具有同源性，與泛素化類似，ISG15修飾底物也需要相關(guān)的E1、E2、E3樣酶進(jìn)行作用，而這個過程即為ISG修飾。E1樣泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme E1-like, UbE1L,或稱為UbA7)是E1樣酶，與ISG15的C端結(jié)合并參與ISG15的激活，活性位點與泛素E1酶具有45%的同一性[10]，研究人員發(fā)現(xiàn)在缺乏UbE1L的小鼠不能形成ISG15偶聯(lián)物[11]。泛素結(jié)合酶E2 L6(ubiquitin conjugating enzyme E2 L6, UbE2L6, 或稱為UbCH8)是ISG15的E2樣酶，兩個課題組的研究人員分別通過對IFN誘導(dǎo)的泛素E2家族酶類篩選[12]、IFN誘導(dǎo)的ISG15結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選[13]得出ISG15的E2酶[13]，在泛素E2酶中，泛素結(jié)合酶E2L3(ubiquitin-conjugating enzyme E2 L 3, UbE2L3,或稱為UbCH7)與UbE2L6在一級序列上具有很高的相似性，泛素E1酶與UbE2L3的親和力較高，而UbE1L與UbE2L6的親和力較高[14]，這一差異可能與N末端結(jié)構(gòu)有關(guān)，UbE2L6的N端可以與UbE1L特異性結(jié)合[4]。E3樣酶負(fù)責(zé)目的蛋白與ISG15的連接，HECT和RLD結(jié)構(gòu)域的 E3 泛素蛋白連接酶5(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 5, HERC5)是ISG修飾過程中的E3樣酶，研究人員發(fā)現(xiàn)，小干擾RNA減少HERC5表達(dá)可以減少ISG修飾，含有HERC5的過表達(dá)可以在無IFN刺激的情況下強烈誘導(dǎo)ISG修飾[15]，HERC5在人中表達(dá)，小鼠中無HERC5蛋白，起相似作用的是含有HECT和RLD結(jié)構(gòu)域的 E3 泛素蛋白連接酶6(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 6, HERC6)[16]。

1.3去ISG修飾ISG15從目標(biāo)蛋白的解離也需要特定酶類，起這個作用的酶主要是泛素特異性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18,USP18,或稱為 UBP43)。1999年研究人員分析AML1-ETO基因敲入小鼠的差異基因時發(fā)現(xiàn)這一蛋白，并且發(fā)現(xiàn)它屬于泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific processing enzyme, UBP)家族[17]，UBP家族酶具有去泛素化的作用，可以將結(jié)合在蛋白上的泛素解離[18]。由于其相對分子質(zhì)量為43 000，因此被命名為UBP43，隨后人類UBP蛋白被更名為泛素特異性肽酶(Ubiquitin Specific Peptidase, USP)，根據(jù)UBP家族蛋白的發(fā)現(xiàn)順序UBP43又被稱為USP18[4]。USP18敲除小鼠顯示干擾素誘導(dǎo)ISG修飾增強，但是并沒有增強蛋白質(zhì)泛素化[19]，同時對感染性疾病的抵抗力更強[20]。由于ISG15與泛素具有同源性，具有與泛素相似的結(jié)構(gòu)，因此一些去泛素化酶也具有去ISG修飾的作用[4]，比如USP2、USP5、USP13和USP14等[21]。

2 ISG15及ISG修飾在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的研究進(jìn)展

2.1 人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染研究人員發(fā)現(xiàn)，艾滋病患者血清及腦脊液ISG15水平均升高[22-23]，高ISG15水平可能與高病毒載量有關(guān)，而長期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以降低ISG15的水平。研究表明ISG15可能是HIV相關(guān)神經(jīng)心理學(xué)障礙的生物標(biāo)記物，在HIV導(dǎo)致的神經(jīng)認(rèn)知障礙中起到一定作用[22-24]，HIV-1 Tg大鼠是HIV感染的嚙齒動物模型，研究人員在大鼠海馬中觀察到ISG15的高表達(dá)以及工作記憶障礙[23]。HIV病毒引起IFN信號通路激活，會誘導(dǎo)ISG15、蛋白53、蛋白21等蛋白的表達(dá)，這些蛋白可以激活不育-α-基序結(jié)構(gòu)域和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)域包含蛋白1并抑制dNTP生物合成，從而阻止HIV的復(fù)制[25]。

2.2寨卡病毒(zika virus, ZIKV)感染孕婦感染ZIKV會導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)腦部畸形。研究人員對巴西18名由寨卡病毒引起的先天性小頭畸形兒童進(jìn)行全基因組甲基化測序，與20名對照組相比，畸形兒童在Rabgap1l、Mx1、Isg15位點發(fā)現(xiàn)了顯著的甲基化改變。Rabgap1l與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有密切關(guān)系，而Mx1和Isg15與病毒感染有關(guān)，感染寨卡病毒會減弱Mx1和Isg15 CpG島的甲基化，這可能會導(dǎo)致黏病毒抵抗蛋白1和ISG15蛋白表達(dá)水平的升高，從而發(fā)揮抗病毒作用[26]。

2.3革蘭陰性桿菌感染脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是內(nèi)毒素的一種。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞[27]，研究人員發(fā)現(xiàn)，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系可以引起ISG修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)升高，例如ISG15、UbE1L、UbE2L6、HERC6等，以及蛋白ISG修飾的增加。隨后研究人員將UbE1L敲除，發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族1總蛋白水平及磷酸化水平均降低，并且趨化因子配體5和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的水平也有下降[3]。這說明ISG15及ISG修飾可能在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)中起到了一定的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的吞噬細(xì)胞，M1型具有促炎作用，而M2型則相反。雖然尚無研究表明ISG15在小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中所起的作用，但是ISG15在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中具有抗炎作用是已被證實的[3]，其也有可能通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換發(fā)揮抗炎作用。

2.4其他引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的感染性疾病在一些其他能夠引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的感染性疾病中，研究人員也觀察到了I型干擾素引起的ISG15水平升高及ISG修飾的增加，比如犬瘟熱病毒[28]、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒[29]、圣路易斯腦炎病毒[30]、β諾達(dá)病毒[31]等。隨著在越來越多感染性疾病中發(fā)現(xiàn)ISG15的變化及其所起到的抗感染作用，其作為一個潛在感染標(biāo)記物也越來越受到關(guān)注。

3 ISG15及ISG修飾在神經(jīng)系統(tǒng)非感染性疾病中的研究進(jìn)展

3.1 抑郁癥抑郁癥是一種全球廣泛流行的精神疾病，抑郁癥患者具有較高的自殺風(fēng)險，并加重家庭和社會負(fù)擔(dān)[32]。有研究人員收集了23個嚴(yán)重抑郁癥(major depressive disorder, MDD)死亡患者的齒狀回腦組織，與對照組無抑郁癥的死亡患者腦組織進(jìn)行RNA測序，發(fā)現(xiàn)在MDD患者中ISG15表達(dá)水平下降。懷孕期間感染病毒或者細(xì)菌引起的母體免疫激活(maternalimmuneactivation, MIA)是精神疾病的獨立預(yù)測因子，有可能導(dǎo)致后代出現(xiàn)抑郁樣行為或抑郁癥[33]。在妊娠大鼠中模擬MIA狀態(tài)，研究人員發(fā)現(xiàn)子代幼鼠會出現(xiàn)神經(jīng)樹突損壞，ISG15表達(dá)增加以及抑郁樣行為，而前額葉皮層ISG15過表達(dá)也可以出現(xiàn)神經(jīng)樹突損壞和抑郁樣行為，抑制ISG15表達(dá)則可以改善這些癥狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MIA誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，從而促進(jìn)ISG15表達(dá)，而ISG15則通過抑制神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)4/RAS相關(guān)蛋白2a通路引起樹突損傷，導(dǎo)致抑郁樣行為[34]。

3.2共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張癥(ataxia telangiectasia, A-T)A-T是一種由于Atm基因缺陷導(dǎo)致的小腦神經(jīng)退行性疾病。以往研究常集中在Atm對DNA損傷做出的反應(yīng)[35]，但是新的研究表明Atm可以抑制ISG修飾并促進(jìn)蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解。研究人員發(fā)現(xiàn)，在A-T患者中，Atm基因突變細(xì)胞中的蛋白ISG修飾水平增高，從而導(dǎo)致蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解受到抑制，而且在Atm敲除小鼠中也觀察到了蛋白的ISG修飾增加[36]，A-T受影響的病變組織為小腦，在A-T小鼠小腦中的ISG15水平比大腦中更高(約為3倍)，ISG15水平呈等位基因依賴性變化，Atm-/->Atm-/+>Atm+/+[37]。這說明在A-T患者中，ISG修飾抑制蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，而異常的Atm無法在這個過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，并有可能與患者的神經(jīng)退行性變有關(guān)[36]。此外，當(dāng)Atm基因突變細(xì)胞的蛋白酶體途徑受抑制時，會激活自噬。作為蛋白質(zhì)更新的補償機制，自噬的過度誘導(dǎo)會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，而ISG15特異性shRNA可以恢復(fù)Atm基因突變細(xì)胞的自噬功能[38]。

3.3腦外傷有研究人員在TBI患者腦脊液及動物模型損傷部位也發(fā)現(xiàn)了ISG15的升高。研究人員在21日齡和24日齡小鼠中建立腦外傷模型，發(fā)現(xiàn)21日齡小鼠的ISG15在發(fā)病后72 h達(dá)到最高，24日齡小鼠的ISG15在發(fā)病后6 h達(dá)到最高[39]。ISG15可以修飾肌動蛋白，影響細(xì)胞的緊密連接而導(dǎo)致生物屏障的破壞[40]。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)可將肌球蛋白輕鏈磷酸化，與肌動蛋白結(jié)合，減弱細(xì)胞緊密連接[41]，影響血腦屏障通透性。在TBI模型中，MLCK能夠增加小鼠的腦水腫[42]。免疫共沉淀顯示ISG15和MLCK能夠共定位，說明ISG15有可能通過影響MLCK造成小鼠的腦水腫與血腦屏障破壞[39]。在軍隊中服役的退伍軍人被診斷出肌萎縮性側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateralizing sclerosis, ALS)的風(fēng)險接近60%[43]，而腦外傷是ALS的危險因素[44]。研究人員發(fā)現(xiàn)，在TBI-ALS患者中，脊髓組織的蛋白ISG修飾增高，但在枕葉中并未觀察到類似的現(xiàn)象。ISG修飾可能與患者的疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且在TBI-ALS患者腦脊液中也發(fā)現(xiàn)了ISG15的增高[45]，這可能與ISG15不僅在胞內(nèi)表達(dá)，也可以作為一個分泌蛋白有關(guān)，病變部位釋放出ISG15，從而作為一個微環(huán)境因子[46]進(jìn)入腦脊液，發(fā)揮調(diào)控作用，提示腦脊液中的ISG15有可能作為一個損傷的標(biāo)記物用于臨床非感染性腦部疾病的研究。

3.4腦缺血與腦外傷的研究不同，研究人員在腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)了ISG15的神經(jīng)保護(hù)作用。在成年小鼠短暫性大腦中動脈閉塞模型(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)中，受損皮層組織的ISG修飾明顯升高，游離的ISG15和ISG修飾主要表達(dá)于梗塞區(qū)域中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，而缺乏ISG15或者UbE1L的小鼠在MCAO中顯示更大的梗塞面積[47]。雖然ISG15是一個類泛素因子，但是泛素傾向于結(jié)合大分子蛋白質(zhì)，與缺血后耐受相關(guān)，而ISG15更傾向于結(jié)合中等分子量蛋白[6]，這暗示了ISG15在缺血性卒中的獨特生物作用。

4 結(jié)語與展望

ISG15的生物學(xué)作用是多樣性的，雖然在有一些疾病中能夠觀察到ISG15的變化以及其可能產(chǎn)生的作用，但如果對其進(jìn)行干預(yù)，是否會引起ISG修飾系統(tǒng)的失衡，從而帶來潛在的不利影響，仍不得而知。因此，對ISG修飾的研究，不僅僅要能夠觀察其生物學(xué)作用，而且要補上中間的一環(huán)，也即ISG15究竟是修飾到何種蛋白上，從而發(fā)揮某種確定的生物學(xué)作用。自ISG15發(fā)現(xiàn)至今，借助高通量研究技術(shù)的發(fā)展，已有多種底物被鑒定[48]。對于其底物的研究有助于更完整地理解ISG15及ISG修飾的生物學(xué)作用。只有了解其修飾蛋白，對ISG修飾系統(tǒng)的干預(yù)才會有更大的概率為疾病的治療帶來獲益。