恩替卡韋對(duì)慢性乙型肝炎外周血Th9/Treg 的影響

郭艷 李華銘 王宇芳 李春霞 劉肄輝

1.杭州市第三人民醫(yī)院消化科，浙江杭州 310009；2.杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院消化肝病科，浙江杭州 310003

近年來(lái)，CD4+T 淋巴細(xì)胞的主要亞群，如輔助性T 淋巴細(xì)胞（helper T cells，Th）1、Th2 和Th17 已被證明在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）誘導(dǎo)的肝臟炎癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和Th17 細(xì)胞在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）中的抗炎和促炎作用已得到證實(shí)，且Treg/Th17 平衡是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能變化的重要指標(biāo)[2,3]。Th9 是CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群新成員，被認(rèn)為在CHB 中具有促炎作用[4]，其在分化與功能上與Treg 細(xì)胞具有一定的相關(guān)性，目前研究認(rèn)為T(mén)reg 細(xì)胞在CHB 中主要起免疫抑制作用[5]，但Th9/Treg 與慢性乙型肝炎的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)Th9/Treg 與CHB 炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]，抗病毒治療作為目前CHB 的主要治療手段能否通過(guò)對(duì)Th9/Treg 的作用而影響療效尚不清楚，本研究觀察恩替卡韋（entecavir，ETV）對(duì)Th9/Treg 的影響及療效的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集杭州市第三人民醫(yī)院2019 年1 月至2020年1 月符合抗病毒治療指征的CHB 患者40 例，診斷及抗病毒指征符合《慢性乙型肝炎防治指南2015年版》[7]，所有患者未接受過(guò)抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等；②排除合并脂肪性、酒精性和遺傳代謝性肝病、失代償性慢性肝病及自身免疫相關(guān)的其他疾?。虎蹮o(wú)心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)重大疾病及精神病患者；④排除妊娠或哺乳期婦女。本研究經(jīng)杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（審批號(hào)：2022KA035），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

符合抗病毒治療指征的CHB 患者予恩替卡韋（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20100019）0.5mg/d 抗病毒治療，觀察時(shí)間24 周，治療前后檢測(cè)患者的血清肝功能、乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）、外周血Th9、Treg 等指標(biāo)。治療24 周后，根據(jù)HBV-DNA 是否轉(zhuǎn)陰分為HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰組及HBV-DNA 未轉(zhuǎn)陰組，并觀察外周血Th9、Treg水平變化。

1.3 主要儀器及試劑

HBV 血清標(biāo)志物采用美國(guó)雅培I-2000 全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）采用日本日立全自動(dòng)7180 生化儀進(jìn)行全自動(dòng)生物化學(xué)分析檢測(cè)，HBV-DNA 采用美國(guó)ABI 公司ABI7000 型全自動(dòng)熒光定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。流式細(xì)胞儀（美國(guó)，Thermo Attune）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.4.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th9 細(xì)胞（CD3+CD8-IL-9+）取125μl 抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培養(yǎng)基和1μl PMA/IonomycinMixture 和1μl BFA/MonensinMixture，取125μl 抗凝血和125μl不含血清的培養(yǎng)基作為對(duì)照，混勻，37℃孵育4～6h，每隔1～2h 取出震蕩混勻，從樣本管和對(duì)照管中取100μl 細(xì)胞懸液至新的流式管中，加入5μl anti-Human CD3 和5μl anti-Human CD8α，震蕩混勻，室溫避光孵育 15min，每管加入 100μl FIX&PERMMedium A，震蕩混勻，室溫避光孵育15min，每管加入2ml 預(yù)冷1×Flow cytometry staining buffer，300×g離心5min，棄上清，每管加入100μl FIX &PERM Medium B 和5μl IL-9 Monoclonal antibody（MH9D1），震蕩混勻，室溫避光孵育15min，每管加入2ml 1×Flow cytometry staining buffer，300×g離心5min，棄上清，每管加入500μl 1×Flow cytometry staining buffer 重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Treg 細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+）在流式管中加入人抗凝血100μl，加入5μl anti-Human CD4，熒光素5-異硫氰酸酯（Fluorescein isothiocyanate isomer I，F(xiàn)ITC）和5μl anti-Human CD25，別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin,APC），渦旋震蕩混勻，室溫避光孵育15min，每管加入2ml 1×FCM lysing solution 工作液，渦旋震蕩混勻，室溫避光孵育15min。室溫下300×g離心5min，棄上清，每管加入2ml 1×Flow cytometry staining buffer，渦旋震蕩混勻，室溫下 300×g離心 5min，棄上清，每管加入 1ml 1×Fixation/Permeabilization 工作液，渦旋震蕩混勻，室溫避光孵育30～60min，每管加入2ml 1×Permeabilization buffer，室溫下300×g離心5min，棄上清，用100μl 1×Permeabilization buffer 重懸沉淀，加入5μl anti-Human Foxp3，藻紅蛋白（phycoerythrin，PE），或5μl Rat IgG2a Isotype control，PE，震蕩混勻，室溫避光孵育至少30min，每管加入2ml 1×Permeabilization buffer，室溫下300×g離心5min，棄上清，每管加入500μl 1×Flow cytometry staining buffer 重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)均值比較采用成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

CHB 患者40 例，男23 例，女17 例，平均年齡（42.72±9.18）歲，HBV-DNA（6.35±1.08）IU/ml。

2.2 ETV 抗病毒治療前后外周血各項(xiàng)指標(biāo)的變化

治療后ALT 水平、HBV-DNA 載量、Th9 頻數(shù)、Treg 頻數(shù)、Th9/Treg 比值均較治療前明顯下降（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 ETV 治療前后的外周血各項(xiàng)指標(biāo)變化（ ）

表1 ETV 治療前后的外周血各項(xiàng)指標(biāo)變化（ ）

2.3 ETV 治療后ALT 復(fù)常與未復(fù)?；颊叩耐庵苎黜?xiàng)指標(biāo)變化

治療24 周后ALT 復(fù)常33 例，未復(fù)常7 例，ALT復(fù)常者ALT 水平、Th9 頻數(shù)、Th9/Treg 比值均低于ALT 未復(fù)常者，Treg 頻數(shù)高于 ALT 未復(fù)常者（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 ETV 治療后ALT 復(fù)常與未復(fù)?；颊叩耐庵苎黜?xiàng)指標(biāo)變化（ ）

表2 ETV 治療后ALT 復(fù)常與未復(fù)常患者的外周血各項(xiàng)指標(biāo)變化（ ）

2.4 ETV 治療后HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰與未轉(zhuǎn)陰患者的外周血各項(xiàng)指標(biāo)變化

治療24 周后HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰34 例，未轉(zhuǎn)陰6例，HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰患者的Th9 頻數(shù)、Th9/Treg 比值低于未轉(zhuǎn)陰者，Treg 頻數(shù)高于未轉(zhuǎn)陰者（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 ETV 治療后HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰與未轉(zhuǎn)陰患者的外周血各項(xiàng)指標(biāo)變化（ ）

表3 ETV 治療后HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰與未轉(zhuǎn)陰患者的外周血各項(xiàng)指標(biāo)變化（ ）

3 討論

目前，核苷（酸）類(lèi)似物（nucleotide analogues，NAs）已廣泛用于臨床治療 CHB，它們?cè)谝种艸BV-DNA 復(fù)制、復(fù)常ALT 水平、改善組織學(xué)和患者預(yù)后方面具有重要作用。NAs 是病毒復(fù)制的高效抑制劑，可選擇性抑制HBV-DNA聚合酶的活性[8-10]。ETV 是臨床實(shí)踐指南推薦的一線抗病毒藥物[11]，在抑制HBV-DNA 復(fù)制和延緩疾病進(jìn)展方面具有較好的治療效果[12,13]。

研究證實(shí)，Th9/Treg 與CHB 炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]。Th9 是以分泌白細(xì)胞介素-9 為特征的CD4+T 細(xì)胞亞群，有研究認(rèn)為其參與CHB 的發(fā)病機(jī)制[14]，而另一類(lèi)CD4+T 細(xì)胞亞群Treg 細(xì)胞被認(rèn)為通過(guò)抑制各種類(lèi)型的細(xì)胞，包括CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞等，在CHB 免疫耐受的發(fā)展和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15,16]。目前多數(shù)研究認(rèn)為T(mén)h17/Treg 參與CHB 的發(fā)病機(jī)制，與肝臟炎癥密切相關(guān)[17-19]。NAs 抗病毒治療有利于Th17/Treg 失衡的恢復(fù)，從而有利于CHB 核心抗原血清轉(zhuǎn)化甚至CHB 表面抗原清除[20-22]。但Th9/Treg 在CHB 中的變化及抗病毒治療對(duì)其影響的相關(guān)研究較少，本文前期研究發(fā)現(xiàn)Th9/Treg 與CHB 炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]，ETV 抗病毒治療能降低CHB患者外周血Th9 頻數(shù)，治療早期Th9 頻數(shù)下降的患者HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率更高[23]。本研究發(fā)現(xiàn)CHB經(jīng)ETV 抗病毒治療24 周后，隨著ALT、HBV-DNA水平的下降，外周血Th9 細(xì)胞頻數(shù)、Treg 頻數(shù)均下降，Th9/Treg 比值下降，提示抗病毒治療對(duì)細(xì)胞免疫功能有影響，具體的機(jī)制可能與ETV 強(qiáng)大的抗病毒作用有關(guān)，且隨著高載量病毒的抑制，肝臟炎癥的始動(dòng)因素得到抑制，Th9 及Treg 水平趨向正常，人體免疫功能得以恢復(fù)，推測(cè)ETV 也可能具有細(xì)胞免疫直接調(diào)節(jié)功能。

ETV 抗病毒治療有利于恢復(fù)Th9/Treg 的失衡，持續(xù)抑制病毒復(fù)制，甚至完全清除。Yan等[13]研究認(rèn)為ETV 具有較強(qiáng)的抗病毒作用，但免疫調(diào)節(jié)作用較弱，對(duì)外周血Th9、Treg 無(wú)影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Treg可能對(duì)Th9 具有免疫抑制作用，前期研究證實(shí)Th9 與ALT 呈正相關(guān)，Th9 起到促炎作用，Treg 與ALT 呈負(fù)相關(guān)，發(fā)揮抗炎作用[6]，Th9 與Treg 在功能上具有拮抗作用；治療24 周后HBV-DNA 未轉(zhuǎn)陰患者中Treg細(xì)胞頻數(shù)低可能打破免疫耐受。Th9/Treg 比值低提示ALT 復(fù)常率、HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰率高，在一定程度上可預(yù)測(cè)CHB 療效。由于觀察時(shí)間短，HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率及HBsAg 轉(zhuǎn)陰率等遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步觀察。

值得探討的是治療前后外周血Th9、Treg 水平并未表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，而均表現(xiàn)為頻數(shù)下降，Th9/Treg比值亦降低，因此推測(cè)Th9/Treg 可能在CHB 不同階段動(dòng)態(tài)變化，從而出現(xiàn)肝臟免疫耐受或免疫激活狀態(tài)。本研究對(duì)ETV 影響CHB 外周血Th9/Treg 進(jìn)行了初步觀察，由于樣本量少，未能進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)論尚待進(jìn)一步證實(shí)，外周血CD4+T 細(xì)胞亞群在CHB中很可能存在一種動(dòng)態(tài)平衡維持CHB 的不同狀態(tài)，其與CHB 的遠(yuǎn)期預(yù)后是否有關(guān)、是否影響HBeAg 轉(zhuǎn)換甚至HBsAg 清除等尚需深入研究。

綜上所述，ETV 抗病毒治療可降低外周血Th9、Treg 水平，降低Th9/Treg 比值，與療效相關(guān)。