超聲輔助纖維素酶法制備蔗葉膳食纖維及其理化特性分析

周永升， 莫小群， 張文婷， 龍勇益， 蘇 龍， 柳富杰*

（1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來(lái)賓 546199；2.廣西科技師范學(xué)院 廣西現(xiàn)代蔗糖業(yè)發(fā)展研究院，廣西 來(lái)賓 546199）

根據(jù)膳食纖維在水中溶解性質(zhì)的不同可分為水溶性膳食纖維（SDF）和不溶性膳食纖維（IDF）（扈曉杰等，2011）。膳食纖維作為人體所需的第七營(yíng)養(yǎng)素，其對(duì)人體有重要的生理作用。因?yàn)樯攀忱w維不能被小腸消化吸收，對(duì)于腸道的蠕動(dòng)和吸收其他食物有著良好的促進(jìn)作用，并且在食用含膳食纖維的食物后，由于其在人體胃中的逗留時(shí)間長(zhǎng)，可以延長(zhǎng)胃的排空時(shí)間，從而減緩對(duì)于糖類(lèi)的吸收、增加飽腹感，這對(duì)于糖尿病和減肥都有良好的作用（鄭文新等，2017）。有研究表明膳食纖維在血脂的調(diào)節(jié)和改善中扮演著重要角色，在一定程度上可以預(yù)防高血壓、高血脂，減少心血管疾病的發(fā)生（譚亮等，2010；袁爾東等，2002）。此外，膳食纖維還有著抗癌作用，谷物和水果中的膳食纖維可以減少人體對(duì)致癌物質(zhì)的吸收，從而有效地預(yù)防結(jié)腸癌等（李欣等，2013）。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于膳食纖維的研究主要致力于食品和醫(yī)療方面（翟麗麗等，2014）。

我國(guó)是甘蔗種植和甘蔗制糖大國(guó)，在甘蔗收割時(shí)產(chǎn)生了大量的蔗梢，約占整根新鮮甘蔗的1/5，但研究開(kāi)發(fā)甚少，只有少部分用作動(dòng)物飼料和回田物料（李玉銘等，2018）。甘蔗葉中除了有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、酯類(lèi)、萜類(lèi)、糖類(lèi)等功能性成分（何耀濤等，2016），還有大量的膳食纖維，纖維含量接近50%，是膳食纖維可靠的來(lái)源（周永升，2017）。然而蔗葉中的木質(zhì)素會(huì)影響到動(dòng)物飼料的適口性，因此蔗葉一般通過(guò)氨化、青貯或微貯處理后只用作反芻動(dòng)物的飼料，這導(dǎo)致甘蔗葉飼料化開(kāi)發(fā)利用進(jìn)程緩慢（周志揚(yáng)等，2021；郭永清等，2021；李標(biāo)等，2020）。使用纖維素酶處理蔗葉，使胞內(nèi)原生質(zhì)暴露出來(lái)，同時(shí)纖維素酶水解甘蔗也能提高還原糖生成量，提高消化率，從而改善青貯甘蔗葉的品質(zhì)（何曉妹，2015）。也有研究證明適量的蔗葉全價(jià)顆粒飼料能提高肉牛的生長(zhǎng)性能（淡明等，2018）。目前，可以使用酶解法、化學(xué)法、物理法或微生物法處理蔗葉而提取或制備膳食纖維，再做成飼料，酶法相對(duì)其他方法所需要的試驗(yàn)條件溫和，很少需要高溫、高壓等，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染小，并且得到的膳食纖維雜質(zhì)較少（林杰等，2011；鄭曉靈，2007）。本研究對(duì)蔗葉進(jìn)行去除蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、木質(zhì)素后，在超聲場(chǎng)中使用酶法制備蔗葉膳食纖維，通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法確定蔗葉膳食纖維的最佳工藝，并對(duì)比分析蔗葉水溶性膳食纖維（SDF）、蔗葉不溶性膳食纖維（IDF）和100目蔗葉粉末的堆積密度、持水力、持油力、溶脹性等指標(biāo)，為提高甘蔗葉的有效利用和膳食纖維的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備 甘蔗葉是收集甘蔗尾葉與種植期間人為剝落部分的混合樣品。酶制劑：熱穩(wěn)定α-淀粉酶（酶活≥3.5 U/mg，上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）、堿性蛋白酶（酶活≥200 U/mg，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）、脂肪酶（酶活≥30 U/mg，上海源葉生物有限公司）、纖維素酶（酶活≥100 U/mg，山東隆科特酶制劑有限公司）。其他試劑均為分析純。儀器設(shè)備：FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、FA2004型分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）、GZX-GF101-3 BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、HH-S8型恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）、H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 甘蔗葉的預(yù)處理 參考林杰等（2011）的方法對(duì)甘蔗葉進(jìn)行去除蛋白質(zhì)、去淀粉、脫脂處理，參考Ann等（2020）、Llanes等（2019）、李春光等（2011）的方法去除木質(zhì)素。（1）粉碎過(guò)篩：將蔗葉洗凈去除雜質(zhì)，干燥后粉碎并過(guò)40目篩。（2）去除蛋白質(zhì)、淀粉：用相對(duì)于蔗葉粉末質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%混合酶（蛋白酶和α-淀粉酶質(zhì)量比為1∶3）溶液浸泡蔗葉粉末，其中液料比為20∶1、溫度為65℃、酶解時(shí)間為90 min，過(guò)濾，再將酶解后的濾渣用蒸餾水洗凈。（3）脫脂：將濾渣用脂肪酶進(jìn)行酶解，脂肪酶用量為0.4%、溫度為50℃、酶解時(shí)間為60 min，100℃滅酶10 min，再用蒸餾水將濾渣洗至中性，放入60℃烘箱烘干，過(guò)40目篩。（4）去除木質(zhì)素：稱(chēng)取上述粉末，按液料比30∶1加入體積分?jǐn)?shù)0.7%的H2O2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH混合溶液，在85℃下攪拌4 h，濾渣用蒸餾水洗凈，60℃干燥后過(guò)40目篩；取堿液處理后的粉末，按液料比30∶1加入31 mL/L乙酸和9.5 g/L NaClO2混合溶液，在75℃下處理1 h，過(guò)濾后用蒸餾水洗滌至中性，60℃烘干后過(guò)100目篩，備用。

1.2.2 蔗葉膳食纖維的制備 稱(chēng)取1 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品→加入液料比20∶1的蒸餾水→用乙酸、乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4→加入一定量纖維素酶→調(diào)節(jié)一定溫度后使用500 W超聲場(chǎng)中酶解一定時(shí)間→100℃水浴滅酶10 min→抽濾（濾渣經(jīng)過(guò)清洗干燥后研磨過(guò)100目篩得到IDF）→濾液濃縮至約10 mL→加入約4倍體積預(yù)熱至60℃的95%的乙醇，室溫下醇沉1 h→抽濾→濾渣90℃干燥至恒重得到SDF。SDF得率代表著酶解程度的大小，因此以SDF得率為考察指標(biāo)，SDF得率/%=SDF質(zhì)量/預(yù)處理樣品的質(zhì)量×100。

1.2.3 酶解條件試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照1.2.2的制備步驟進(jìn)行?？紤]纖維素酶添加量（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酶解溫度（40、45、50、55、60℃）、酶解時(shí)間（10、20、30、40、50 min）3個(gè)因素和水平。固定酶解溫度50℃、酶解時(shí)間20 min，以SDF得率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)得到最佳纖維素酶添加量，再依次確定最佳酶解溫度和最佳酶解時(shí)間。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以SDF得率為指標(biāo)進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。確定最佳制備工藝，并建立數(shù)學(xué)模型，分析因素間的相互作用。通過(guò)規(guī)劃求解后得到酶解條件的理論值，重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢查工藝的穩(wěn)定性、模型的準(zhǔn)確性。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 蔗葉膳食纖維的理化特性分析 參考巫永華等（2020）、李晗等（2020）和郝曉華等（2021）的方法，分別測(cè)定并比較蔗葉SDF、蔗葉IDF（酶解后的濾渣經(jīng)過(guò)清洗干燥后研磨過(guò)100目篩）和100目蔗葉粉末的堆積密度、持水力、持油力、溶脹性。

堆積密度的測(cè)定：稱(chēng)取0.1000 g樣品于5 mL離心管中，記錄體積。堆積密度/（g/cm3）=樣品質(zhì)量/樣品體積。

持水力的測(cè)定：稱(chēng)取0.1000 g樣品于5 mL離心管中，加入1.5 mL蒸餾水，混勻，室溫靜置24 h，4000 r/min離心20 min，棄上清液，稱(chēng)重。持水力/（g/g）=（樣品濕重-樣品干重）/樣品干重。

持油力的測(cè)定：稱(chēng)取0.1000 g樣品于5 mL離心管中，加入市售大豆油2 mL，振蕩搖勻，室溫下放置1.5 h，4000 r/min的條件下離心30 min，除去上清液，稱(chēng)重。持油力/（g/g）=（樣品吸油后重量-樣品干重）/樣品干重。

溶脹性的測(cè)定：稱(chēng)取0.2000 g樣品，使用10 mL量筒量取體積后，將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL量筒中，加入約25 mL蒸餾水，振蕩均勻，室溫靜置24 h，觀察樣品的自由膨脹體積。溶脹性/（mL/g）=（吸水后樣品體積-吸水前樣品體積）/吸水前樣品體積。

1.3數(shù)據(jù)處理 通過(guò)Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和表格制作，使用minitab 18進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算和多重比較分析（α=0.05），運(yùn)用origin2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1酶解條件單因素結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量 由圖1可知，SDF得率先顯著上升后（P＜0.05）再趨于平緩。當(dāng)酶添加量小于0.4%時(shí)，SDF得率隨著纖維素酶添加量的增加逐漸上升，在酶添加量為0.4%時(shí)得率達(dá)到最大，為4.69%；當(dāng)酶添加量添加至0.5%時(shí)，得率反而有所下降。因?yàn)槊附猱a(chǎn)物隨著酶濃度地升高而升高，但當(dāng)酶的濃度過(guò)大時(shí)，部分膳食纖維被進(jìn)一步水解成低聚糖，該低聚糖不能被乙醇沉淀而降低SDF得率（巫永華等，2020；李晗等，2020）。經(jīng)過(guò)多重比較發(fā)現(xiàn)，酶添加量0.3%和0.4%無(wú)顯著差異（P＞0.05），基于低耗節(jié)能原則，確定酶添加量為0.3%。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)SDF得率的影響

2.1.2 酶解溫度 由圖2可知，SDF得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。溫度過(guò)低時(shí)酶的活性較低，酶解效果不好，隨著酶解溫度的升高，酶的活性升高，SDF得率也在上升，在酶解溫度達(dá)到50℃時(shí)，得率為4.64%。但當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致酶的部分失活，同時(shí)也導(dǎo)致溶液的黏度變大會(huì)導(dǎo)致底物與酶的接觸困難，使得SDF得率下降（巫永華等，2020；李晗等，2020）。因此，確定最佳酶解溫度為50℃。

圖2 酶解溫度對(duì)SDF得率的影響

2.1.3酶解時(shí)間 由圖3可知，SDF得率隨著酶解時(shí)間的增加而上升，再趨于平緩。酶解時(shí)間的不足導(dǎo)致了纖維素不能充分分解，當(dāng)酶解時(shí)間為20 min時(shí)，SDF得率最高為4.67%；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，SDF得率有所下降。下降的原因可能是長(zhǎng)時(shí)間在酶的水解和超聲波的空穴效應(yīng)、微機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)的共同作用下使得膳食纖維發(fā)生降解成乙醇無(wú)法沉淀的低聚糖（巫永華等，2020；李晗等，2020）。經(jīng)過(guò)多重比較發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間20 min之后無(wú)顯著差異（P＞0.05），同時(shí)基于低耗節(jié)能原則，確定酶解溫度為20 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)SDF得率的影響

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間為考察因素，以SDF得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以得到SDF得率（Y）的多項(xiàng)式回歸方程（自然變量）。方程為：Y=-50.905+18.828A+2.064B+0.148C-0.065AB+0.110AC-8.500×10-4BC-26.650A2-0.02056B2-3.015×10-3C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。其中，F(xiàn)值可用于測(cè)試每個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值的意義。F越大，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。當(dāng)顯著性檢驗(yàn)P<0.05時(shí)，說(shuō)明其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表3可以得出結(jié)論，模型P＜0.0001，該模型已達(dá)極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.4423＞0.05（不顯著），決定系數(shù)R2=0.9877，說(shuō)明具有較高的顯著性，而R2adj=0.9719，能夠解釋試驗(yàn)97.19%的響應(yīng)值變化，且預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2Pred=0.8999，CV=1.65，說(shuō)明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c真試數(shù)據(jù)擬合程度良好，擬合度較高，可用于分析和預(yù)測(cè)蔗葉SDF的制備效果。回歸方程系數(shù)的顯著性分析：A、B、C、A2、B2、C2對(duì)SDF得率的影響達(dá)到極顯著水平，AC對(duì)SDF得率的影響達(dá)到顯著水平。酶解條件對(duì)SDF得率影響大小順序?yàn)椋篊>A>B，即酶解時(shí)間>纖維素酶添加量>酶解溫度。

表3 SDF得率回歸方程的方差分析結(jié)果

圖4是根據(jù)上述回歸方程繪出的各因素交互作用對(duì)SDF得率影響的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面圖。等高線(xiàn)越接近橢圓表明兩因素交互作用越強(qiáng)，且等高線(xiàn)越密集則影響效果越大；響應(yīng)曲面圖呈凸面，直觀地反映了這些因素對(duì)SDF得率的影響。在所研究的區(qū)域內(nèi)均存在一個(gè)極值點(diǎn)，隨著各因素從小到大變化，SDF得率呈現(xiàn)先增后減（或先增后緩）的趨勢(shì)，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果相一致。其中，結(jié)合表3可知，交互項(xiàng)AC的P值為0.0159，表明纖維素酶添加量和酶解時(shí)間之間的交互影響達(dá)到顯著水平。

圖4 各因素交互作用對(duì)SDF得率影響的等高線(xiàn)及響應(yīng)面圖

2.2.2優(yōu)化酶解條件及驗(yàn)證結(jié)果與分析 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析，并對(duì)方程進(jìn)行規(guī)劃求解，得到最佳酶解條件為：酶添加量0.3%、酶解溫度49℃、酶解時(shí)間23 min，此時(shí)模型理論結(jié)果為SDF得率4.82%。進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，SDF得率分別為4.76%、4.66%、4.84%、4.74%和4.83%，SDF平均得率為4.766%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近。通過(guò)t檢驗(yàn)分析（α=0.05），經(jīng)過(guò)雙尾檢驗(yàn)可知重復(fù)試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值沒(méi)有顯著差異，再經(jīng)過(guò)單尾檢驗(yàn)可知重復(fù)試驗(yàn)的SDF得率沒(méi)有顯著減小，表明所建回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)效果。

2.3蔗葉膳食纖維理化特性分析結(jié)果 蔗葉SDF、蔗葉IDF和100目蔗葉粉末的堆積密度、持水力、持油力和溶脹性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。這些是評(píng)價(jià)膳食纖維功能的重要指標(biāo)，顆粒大小、形狀和疏水－親水相互作用都影響著這些指標(biāo)（巫永華等，2020；李晗等，2020；郝曉華等，2021）。

表4 蔗葉膳食纖維及蔗葉粉末的理化特性測(cè)定結(jié)果

堆積密度反映樣品的疏松程度，堆積密度越小，其結(jié)構(gòu)越疏松，比表面積越大，表面活性的特性也越好。蔗葉SDF的堆積密度相對(duì)于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別減少了24.72%、30.93%。

持水力和溶脹性較高，起到了促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、使人產(chǎn)生飽腹感、增加糞便體積和水分的作用，這易于有害物質(zhì)快速排出體外。蔗葉SDF的持水力相對(duì)于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別增加了48.21%、86.82%。蔗葉SDF的溶脹性相對(duì)于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別增加了9.89%、167.73%。這可能是因?yàn)槌暫兔附獯蜷_(kāi)了纖維素分子間的部分次級(jí)鍵，使親水基團(tuán)暴露，提高了水合性質(zhì)。

膳食纖維對(duì)脂肪的結(jié)合能力是評(píng)價(jià)其對(duì)脂溶性組分吸附能力的重要指標(biāo)。蔗葉SDF的持油力相對(duì)于蔗葉IDF和100目蔗葉粉末相比差異顯著（P＜0.05），分別增加了97.10%、161.54%。這可能是超聲和酶解處理破壞了纖維原有致密結(jié)構(gòu)，使更多的親水性基團(tuán)和一些非極性基團(tuán)同時(shí)暴露出來(lái)，從而提高了與脂肪的結(jié)合力。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面結(jié)果可知，蔗葉SDF最佳制備的酶解條件為纖維素酶添加量0.3%、酶解溫度49℃、酶解時(shí)間23 min，此時(shí)蔗葉SDF得率為4.82%。建立的數(shù)學(xué)模型與真實(shí)數(shù)據(jù)擬合度較高，可用于分析和預(yù)測(cè)蔗葉SDF的制備效果。在最佳工藝條件下制備的蔗葉SDF與蔗葉IDF、100目蔗葉粉末相比堆積密度、持水力、持油力和溶脹性都顯著得到了改善。研究結(jié)果為蔗葉膳食纖維的開(kāi)發(fā)和其在功能食品或動(dòng)物飼料中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。