FISH技術(shù)檢測(cè)MDM2基因在脂肪肉瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值及技術(shù)質(zhì)控

李 霄，時(shí)姍姍，呂君文，丁 穎，貢其星，李 海，李紅霞

脂肪肉瘤是常見的軟組織惡性腫瘤，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)多樣，其診斷及鑒別診斷困難。目前WHO(2013)軟組織和骨腫瘤分類確定4種主要的脂肪肉瘤亞型：(1)非典型脂肪瘤樣腫瘤/高分化脂肪肉瘤(atypical lipomatous tumor/well-differentiated liposarcoma, ALT-WDLPS)；(2)去分化脂肪肉瘤；(3)黏液樣脂肪肉瘤；(4)多形性脂肪肉瘤。這4種主要亞型具有獨(dú)特的組織學(xué)特點(diǎn)、分子遺傳學(xué)改變及臨床表現(xiàn)[1-2]，正確分類及精準(zhǔn)診斷對(duì)患者選擇最佳治療方案至關(guān)重要。臨床實(shí)踐中，ALT-WDLPS和良性脂肪性腫瘤以及去分化脂肪肉瘤和高級(jí)別肉瘤在形態(tài)上常有重疊，易誤診[3]。研究證實(shí)ALT-WDLPS和去分化脂肪肉瘤存在共同的遺傳學(xué)特征，即攜帶有MDM2、CDK4、HMGA2等基因擴(kuò)增序列的超額染色體[4]。FISH技術(shù)可原位辨識(shí)組織細(xì)胞內(nèi)基因組片段的拷貝數(shù)變化。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)在脂肪肉瘤不同亞型的鑒別診斷中具有良好的應(yīng)用前景。然而，目前FISH技術(shù)檢測(cè)MDM2基因擴(kuò)增尚無(wú)權(quán)威診斷指南可供參考，結(jié)果判讀多依賴相關(guān)文獻(xiàn)及病理診斷醫(yī)師既往經(jīng)驗(yàn)，且檢測(cè)易受組織前處理、變性雜交、人員操作等諸多因素的影響，其仍未實(shí)現(xiàn)全流程質(zhì)控[5]。本文擬探討MDM2基因擴(kuò)增在脂肪肉瘤鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值，分析FISH技術(shù)檢測(cè)全過程質(zhì)控環(huán)節(jié)，期望建立規(guī)范化的操作流程，保障結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2020年12月我院病理科脂肪源性腫瘤417例，其中ALT-WDLPS 196例，去分化脂肪肉瘤97例，黏液性脂肪肉瘤15例、多形性脂肪肉瘤22例，良性脂肪性腫瘤87例。

1.2 主要儀器及試劑熒光顯微鏡Olympus BX51(日本奧林巴斯公司)；圖像分析系統(tǒng)Imstar(法國(guó)IMSTAR公司)；MDM2(12q15)基因探針(廣州安必平醫(yī)藥公司)。

1.3 FISH法(1)切片：石蠟組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水包埋，3～4 μm厚連續(xù)切片，置于防脫載玻片上。(2)烤片及脫蠟：70 ℃烤片30～60 min；將切片依次置于3缸二甲苯中脫蠟，室溫，每次10 min；再依次置于2缸100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇，室溫，每次5 min，流水沖洗3 min。(3)修復(fù)：將切片置于中性緩沖溶液中，水浴煮沸，煮片20 min。(4)消化：胃酶工作液(2.5 mg/mL)于水浴鍋中37 ℃消化5～10 min，鏡下觀察細(xì)胞核裸露情況調(diào)整消化時(shí)間，消化至細(xì)胞核清晰且背景較暗時(shí)方可。(5)洗片：將玻片置于2×SSC溶液中室溫漂洗2次，每次3～5 min；將玻片依次置于70%、85%、100%梯度乙醇中脫水各2 min，自然晾干。(6)添加探針：配置MDM2基因探針，移液器吸取10 μL滴于組織上，蓋玻片封片，封片膠封于蓋玻片四周，將玻片置于濕盒中。(7)變性及孵育：水浴箱83 ℃變性10 min；將濕盒置于孵箱37 ℃烘箱過夜孵育。(8)洗片及復(fù)染：次日取出玻片，輕輕取下蓋玻片，防止損傷組織，置于70 ℃ 0.4×SSC溶液中2 min；室溫2×SSC漂洗2 min后，置于70%乙醇溶液3 min，并于暗處自然晾干；每張切片加10～15 μL的DAPI復(fù)染，靜置10 min后在熒光顯微鏡下閱片。

1.4 結(jié)果判讀MDM2基因在正常細(xì)胞核上為2紅、2綠信號(hào)；當(dāng)紅綠信號(hào)比值>2.0時(shí)判讀為陽(yáng)性；特殊情況下紅綠信號(hào)比值<2.0，但紅信號(hào)拷貝數(shù)>5.0時(shí)，提示MDM2基因高拷貝擴(kuò)增[6-8]，表明此時(shí)MDM2基因擴(kuò)增有意義，報(bào)告中予以注釋。FISH結(jié)果均由1位高年資病理診斷醫(yī)師及1位高年資病理技術(shù)員采用雙盲法進(jìn)行判讀，如出現(xiàn)結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)重復(fù)閱片再次計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各類脂肪源性腫瘤的臨床特征417例脂肪源性腫瘤中女性195例，男性222例，年齡13～98歲；發(fā)生于腹腔74例，腹膜后73例，軀干70例，四肢131例，睪丸旁13例，腹股溝9例，縱隔16例，頭頸部31例(表1)。

2.2 FISH檢測(cè)ALT-WDLPS 196例，MDM2擴(kuò)增陽(yáng)性194例(194/196，98.9%)，擴(kuò)增信號(hào)均為簇狀擴(kuò)增(圖1A)。其中1例可疑陽(yáng)性，此例信號(hào)極弱，經(jīng)多次重復(fù)檢測(cè)依然未能明確診斷；另1例陰性，此例更換多個(gè)蠟塊重復(fù)檢測(cè)最終證實(shí)為陽(yáng)性，回顧性分析其HE切片，腫瘤具有異質(zhì)性。去分化脂肪肉瘤97例，陽(yáng)性95例(97.9%，圖1B)，陰性2例，結(jié)合臨床表現(xiàn)和組織學(xué)特征依然診斷為去分化脂肪肉瘤(2例腫瘤均位于腹膜后，HE染色可見經(jīng)典高分化脂肪肉瘤區(qū)域過渡到多形性肉瘤區(qū)域)。黏液性脂肪肉瘤16例，均未見MDM2陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)；多形性脂肪肉瘤22例，部分散在異型大細(xì)胞核內(nèi)可見MDM2低拷貝點(diǎn)狀擴(kuò)增信號(hào)(圖1C)，但不符合陽(yáng)性診斷閾值。良性脂肪性腫瘤中僅見1例MDM2低拷貝點(diǎn)狀擴(kuò)增信號(hào)，未見簇狀擴(kuò)增。

2.3 FISH檢測(cè)中的技術(shù)難點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用FISH技術(shù)檢測(cè)MDM2基因的過程中仍存在一些技術(shù)難點(diǎn)，主要出現(xiàn)信號(hào)較弱或無(wú)信號(hào)問題，如：(1)組織前期固定不及時(shí)或不充分，經(jīng)酶消化后細(xì)胞核彌散或者有空洞，造成信號(hào)丟失(圖2A)，易誤判，本組ALT-WDLPS中有1例可疑陽(yáng)性，腫瘤體積較大，未及時(shí)切開固定，造成固定不充分，組織變性明顯，使組織內(nèi)蛋白及核酸溶解，導(dǎo)致檢測(cè)失敗。(2)含酸類脫鈣液(如鹽酸脫鈣液)會(huì)使DNA和RNA嚴(yán)重降解，導(dǎo)致熒光鏡下細(xì)胞核內(nèi)無(wú)熒光信號(hào)(圖2B)。(3)酶消化不足會(huì)造成蛋白消化不透徹，無(wú)法觀察到暴露的細(xì)胞核，從而降低了雜交效率且增加判讀難度；消化過度則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核消失或辨認(rèn)不清，導(dǎo)致信號(hào)丟失影響判讀(圖2C)。(4)腫瘤異質(zhì)性的存在，本組ALT-WDLPS中有1例初測(cè)陰性，回顧性分析HE切片以分化良好的脂肪成分為主，未見明確間質(zhì)異型細(xì)胞及脂肪母細(xì)胞，MDM2檢測(cè)未見明確擴(kuò)增，后更換間質(zhì)細(xì)胞豐富的蠟塊，再次行FISH檢測(cè)顯示MDM2基因簇狀擴(kuò)增從而明確診斷。

3 討論

脂肪肉瘤約占軟組織肉瘤的15%，可發(fā)生于全身多個(gè)部位，尤其好發(fā)于深部軟組織，占四肢軟組織肉瘤的24%，占腹腔、腹膜后軟組織肉瘤的45%[2]，其對(duì)放、化療不敏感，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，因此對(duì)于脂肪肉瘤應(yīng)早發(fā)現(xiàn)、早治療，降低其復(fù)發(fā)擴(kuò)散的可能性。良性脂肪性腫瘤與高分化脂肪肉瘤及脂肪肉瘤各亞型在組織學(xué)形態(tài)層面常存在重疊，給鑒別診斷帶來(lái)困難[9]。由于良、惡性脂肪肉瘤及不同亞型脂肪肉瘤均具有不同的生物學(xué)行為、預(yù)后以及治療手段，因此正確診斷及分型對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥及提示患者預(yù)后具有重要意義[8-9]。

近年，F(xiàn)ISH作為分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)被廣泛用于臨床病理檢測(cè)，包括輔助鑒別診斷、疾病預(yù)后評(píng)估和指導(dǎo)臨床靶向藥物治療等。研究表明ALT-WDLPS和去分化脂肪肉瘤具有相似的基因組學(xué)改變，即位于12q14-15染色體的MDM2、CDK4、HMGA2等諸多基因的特異性擴(kuò)增[5]。利用FISH技術(shù)檢測(cè)MDM2基因擴(kuò)增狀態(tài)已成為多數(shù)醫(yī)院診斷脂肪肉瘤亞型的主要手段。由于目前尚無(wú)統(tǒng)一的判讀標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致MDM2基因的判讀結(jié)果具有主觀差異性，F(xiàn)ISH結(jié)果與最后診斷結(jié)果的符合率尚不明確，從而給后期診斷及治療帶來(lái)不利影響。

本組分析417例脂肪源性腫瘤的FISH檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MDM2基因擴(kuò)增FISH檢測(cè)可作為診斷ALT-WDLPS和去分化脂肪肉瘤的可靠手段，此兩種亞型中MDM2基因簇狀擴(kuò)增陽(yáng)性率分別為98.9%、97.9%，F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果與最終診斷結(jié)果具有較高的吻合率。但是也有少數(shù)良性病變存在MDM2基因低拷貝點(diǎn)狀擴(kuò)增，根據(jù)其臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)及免疫表型，最終診斷為脂肪瘤等其它良性脂肪性腫瘤。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黏液性脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤的MDM2基因擴(kuò)增陽(yáng)性率均為0，表明該基因在脂肪肉瘤不同亞型的診斷上具有重要的鑒別意義。實(shí)際工作中觀察到黏液性脂肪肉瘤中均未見MDM2基因擴(kuò)增信號(hào)，但在多形性脂肪肉瘤中會(huì)出現(xiàn)散在的部分腫瘤細(xì)胞MDM2基因呈低拷貝點(diǎn)狀擴(kuò)增，未達(dá)診斷閾值。因此臨床病理醫(yī)師在脂肪源性腫瘤的診斷過程中，不可僅依靠FISH檢測(cè)結(jié)果，還是要綜合分析患者的臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)和分子遺傳學(xué)等多方面特征，才能最終得出精準(zhǔn)診斷。

表1 各類脂肪源性腫瘤的臨床病理特點(diǎn)[n(男 ∶女)]

①A①B①C②A②B②C

在FISH檢測(cè)及結(jié)果判讀過程中，仍有諸多影響因素，如因組織固定的不及時(shí)及充分、脫鈣液使用不當(dāng)、腫瘤異質(zhì)性、人為原因的操作失誤以及設(shè)備性能的不穩(wěn)定性等，均可能影響最終的檢測(cè)結(jié)果。因此，我們需要重視檢測(cè)全流程的質(zhì)控、綜合分析，確保FISH檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

作者總結(jié)了影響FISH檢測(cè)質(zhì)控的幾個(gè)環(huán)節(jié)，并提出以下解決方案：(1)按照規(guī)范及時(shí)并充分固定手術(shù)大標(biāo)本及穿刺活檢小標(biāo)本；(2)骨組織標(biāo)本取材時(shí)應(yīng)盡可能刮取旁邊的軟組織進(jìn)行常規(guī)固定脫水，無(wú)軟組織必須脫鈣處理時(shí)，此樣本不適于FISH檢測(cè)；(3)煮片時(shí)間不宜過短，過短易造成蛋白解交聯(lián)不充分；(4)摸索適宜本實(shí)驗(yàn)室的消化酶濃度及消化時(shí)長(zhǎng)，定時(shí)觀察鏡下每張切片的消化程度，控制消化時(shí)間；(5)定期監(jiān)測(cè)檢測(cè)設(shè)備的溫度、濕度是否準(zhǔn)確；(6)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備及試劑特點(diǎn)制定適宜本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并定期培訓(xùn)。另外，統(tǒng)一的判讀方式是質(zhì)控環(huán)節(jié)的一部分，針對(duì)FISH結(jié)果判讀，作者提出以下一些見解：(1)判讀時(shí)應(yīng)計(jì)數(shù)紅綠通路信號(hào)點(diǎn)均為清晰可辨的細(xì)胞，并明確為腫瘤細(xì)胞方可計(jì)數(shù)；(2)紅綠信號(hào)點(diǎn)不均勻的細(xì)胞區(qū)域不予計(jì)數(shù)；(3)細(xì)胞有重疊或者細(xì)胞核分辨不清的區(qū)域不予計(jì)數(shù)；(4)有雜信號(hào)或者非特異著色的區(qū)域不予計(jì)數(shù)；(5)當(dāng)結(jié)果可疑時(shí)，需由兩名醫(yī)師計(jì)數(shù)，保證結(jié)果一致；(6)信號(hào)微弱或者有空洞的區(qū)域不予計(jì)數(shù)；(7)腫瘤異質(zhì)性明顯的組織，建議更換組織檢測(cè)。

綜上所述，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)MDM2基因在脂肪肉瘤鑒別診斷中具有重要意義，并針對(duì)檢測(cè)過程中可能遇到的技術(shù)難點(diǎn)及質(zhì)控環(huán)節(jié)提出全面的質(zhì)量控制要求。在實(shí)際工作中，由于技術(shù)本身的局限性，F(xiàn)ISH檢測(cè)也會(huì)出現(xiàn)模棱兩可的判讀結(jié)果，此時(shí)可利用多種方法如全外顯子組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組學(xué)(RNA-seq)等高通量技術(shù)相互驗(yàn)證[10-11]，這對(duì)于疾病的診斷與鑒別診斷將大有裨益。