激活蛋白-1家族成員JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun在初診多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及臨床意義*

燕法紅,邱志遠(yuǎn),李乾鵬,高偉杰,曹榮旋,王寶宏△

1.濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/濰坊市人民醫(yī)院血液內(nèi)科，山東濰坊 261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種克隆性漿細(xì)胞異常增殖的惡性疾病，約占造血系統(tǒng)疾病的10%，也是血液系統(tǒng)第2常見的惡性腫瘤[1]。近些年來，隨著蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、單克隆抗體等新的MM治療藥物不斷涌現(xiàn)及造血干細(xì)胞移植的進(jìn)一步應(yīng)用，MM患者的預(yù)后得到了明顯改善，但目前其仍然是一種不可治愈的疾病。進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制并探索有效的治療藥物是臨床亟待解決的難題。轉(zhuǎn)錄是DNA通過RNA聚合酶將遺傳信息復(fù)制給RNA的過程，是基因表達(dá)的第一步。轉(zhuǎn)錄過程異常在MM的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，其可干擾活化的B細(xì)胞向漿細(xì)胞正常分化，影響免疫球蛋白生成及骨髓微環(huán)境信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致MM的發(fā)生并推動(dòng)其進(jìn)展。在轉(zhuǎn)錄過程中，轉(zhuǎn)錄因子(TF)是一種非常重要的因子，只有當(dāng)TF結(jié)合在其識(shí)別的DNA序列上后才能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。激活蛋白-1(AP-1)是一類重要的TF，通常由Jun蛋白家族(c-Jun、JunB和JunD)、Fos蛋白家族(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、ATF蛋白家族(ATF2、ATF3/LRF1、B-ATF、JDP1、JDP2)和Maf蛋白家族(c-Maf、MafA、MafB、MafF/G/K和Nrl)蛋白亞基中的亮氨酸拉鏈區(qū)域形成同源或異源二聚體，與DNA靶序列結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)[2]。組成成分不同的AP-1二聚體對(duì)反應(yīng)元件親和性不同，其中Jun-Fos異源二聚體 DNA 結(jié)合活性最高、最穩(wěn)定，也是人類細(xì)胞中AP-1存在的主要形式。作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子開關(guān)，AP-1參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化、遷移等多種過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3-10]。作為TF，AP-1家族在MM的病理生理過程中起到了很大作用，隨著對(duì)其研究的不斷深入，AP-1家族成員近年來逐漸成為被廣泛開發(fā)的治療新靶點(diǎn)，有望開辟M(fèi)M治療的新領(lǐng)域。

MM患者臨床指標(biāo)的變化包括血紅蛋白(Hb)、清蛋白(ALB)水平降低，血清β2-微球蛋白(β2-MG)、球蛋白(GLO)、血肌酐(Scr)、血鈣水平升高，骨髓中異常漿細(xì)胞比例增高等，這些指標(biāo)的水平變化與患者的病情嚴(yán)重程度、分期、預(yù)后及治療方案的選擇等均有關(guān)。關(guān)于AP-1家族成員與這些臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，相關(guān)報(bào)道較少。本研究探討了初診MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平與上述臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性，并了解其與患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系，旨在明確其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年11月至2022年2月濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科收治的40例初診MM患者作為研究對(duì)象，其中男23例，女17例；年齡39～83歲，平均(64.90±9.35)歲；國際分期系統(tǒng)(ISS)分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期22例。MM診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)參照《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)》[1]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器 PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix Ex Taq熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司，Trizol試劑購自杭州艾科瑞生物科技有限公司，紅細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由華大基因科技股份有限公司合成。Light Cycler480熒光定量 PCR 儀購自瑞士羅氏公司。

1.3方法

1.3.1骨髓有核細(xì)胞提取與凍存 MM患者行常規(guī)骨髓穿刺，抽取骨髓液2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，加入紅細(xì)胞裂解液，室溫下靜置10 min，300×g離心10 min，PBS洗滌2次，棄上清液，細(xì)胞沉淀中加入Trizol試劑，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平 提取總RNA，按照PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。然后進(jìn)行PCR，按照TB Green Premix Ex Taq熒光定量試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件：變性95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；融解95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃，1個(gè)循環(huán)；降溫50 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun及內(nèi)參β-actin的引物序列見表1。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA的表達(dá)水平。

1.3.3臨床指標(biāo)收集 收集MM患者的臨床指標(biāo)，包括年齡、血清β2-MG、Hb、GLO、ALB、Scr、血鈣、骨髓漿細(xì)胞比例。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1MM患者臨床指標(biāo)水平 納入的MM患者Hb(90.95±28.92)g/L，GLO(52.05±26.20)g/L，ALB(35.06±8.55)g/L，血清β2-MG 5.65(4.20,9.12)mg/L,Scr 78.50(60.50,175.00)μmol/L,血鈣(2.50±0.51)mmol/L，骨髓漿細(xì)胞比例(37.70±22.03)%。

2.2不同性別MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平比較 不同性別MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3不同ISS分期MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平比較 ISS分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表2 不同性別MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平比較或M(P25,P75)]

表3 不同ISS分期MM患者JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平比較或M(P25,P75)]

2.4MM患者JunB mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性 MM患者JunB mRNA表達(dá)水平與GLO水平呈正相關(guān)(r=0.320,P=0.044)，與其余指標(biāo)水平無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 MM患者JunB mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性

2.5MM患者c-Maf mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性 MM患者c-Maf mRNA表達(dá)水平與GLO水平呈正相關(guān)(r=0.350,P=0.027)，與ALB水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.316,P=0.047)，與其余指標(biāo)水平無相關(guān)性(P>0.05)，見表5。

表5 MM患者c-Maf mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性

2.6MM患者c-Fos mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性 MM患者c-Fos mRNA表達(dá)水平與血鈣水平呈正相關(guān)(r=0.317,P=0.046)，與其余指標(biāo)水平無相關(guān)性(P>0.05)，見表6。

表6 MM患者c-Fos mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性

2.7MM患者c-Jun mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性 MM患者c-Jun mRNA表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)水平均無相關(guān)性(P>0.05)，見表7。

表7 MM患者c-Jun mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平間的相關(guān)性

3 討 論

AP-1功能異常與淋巴瘤、MM等血液系統(tǒng)腫瘤關(guān)系密切。在淋巴瘤中，AP-1在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性皮膚淋巴瘤等多種亞型中表達(dá)異常[11-12]。在MM中，AP-1不同亞家族蛋白在MM發(fā)生的不同環(huán)節(jié)中扮演不同的角色。MM的發(fā)生涉及B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化、免疫球蛋白的產(chǎn)生與分泌、血管新生、骨病發(fā)生、骨髓微環(huán)境調(diào)節(jié)等。Fra-1可抑制B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，抑制免疫球蛋白生成[13]；Fra-2在多個(gè)不同階段促進(jìn)B細(xì)胞增殖與分化；B-ATF與B細(xì)胞的活化、生發(fā)中心形成、免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換有關(guān)；c-Maf、MafB可促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、黏附，以及與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用，并誘導(dǎo)對(duì)硼替佐米及卡非佐米耐藥；c-Jun抑制MM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；JunB促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)MM細(xì)胞對(duì)激素與硼替佐米耐藥，并促進(jìn)血管新生。此外，c-Fos、Fra-1、Fra-2、JunB都可影響成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的功能，與MM骨病的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]。除MM與淋巴瘤外，AP-1在急性髓系白血病中亦可見異常表達(dá)[17]。鑒于AP-1在MM發(fā)病及進(jìn)展中的作用，近年來以AP-1作為治療靶點(diǎn)的藥物不斷被研發(fā)，個(gè)別藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，這些藥物可通過抑制AP-1的表達(dá)、誘導(dǎo)AP-1降解、干擾AP-1蛋白之間的相互作用、干擾AP-1與DNA結(jié)合，以及表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控等機(jī)制起到抗腫瘤作用[6-7,18-21]。

FAN等[10]研究了AP-1家族中最常見的成員(JunB、c-Jun、JunD、c-Fos、c-Maf)在MM中的作用，發(fā)現(xiàn)JunB作用最突出,將MM細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培育，JunB在mRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯上調(diào)，且JunB與其靶點(diǎn)的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于其他AP-1家族成員；骨髓微環(huán)境中的生長因子，特別是白細(xì)胞介素-6，可上調(diào)MM細(xì)胞中JunB的表達(dá)；JunB表達(dá)敲低后，MM細(xì)胞的生長明顯被抑制，凋亡通路失調(diào)，磷脂酰肌醇-3激酶、核因子-κB(NF-κB)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子、絲裂原活化蛋白激酶等重要信號(hào)通路失調(diào)，其他受到調(diào)控的生物學(xué)過程或分子包括DNA復(fù)制、代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞表面分子、細(xì)胞因子、生長因子等。在激素耐藥MM細(xì)胞株中，JunB的表達(dá)水平高于激素敏感MM細(xì)胞株；激素耐藥MM細(xì)胞株在敲低JunB的表達(dá)后可恢復(fù)對(duì)激素的敏感性，細(xì)胞增殖與存活被抑制[10]。在MM細(xì)胞株中誘導(dǎo)JunB表達(dá)能使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)硼替佐米的抵抗，有助于細(xì)胞存活；同時(shí)在正常漿細(xì)胞、意義未明單克隆免疫球蛋白血癥、冒煙型MM、MM等不同階段的漿細(xì)胞疾病患者中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后JunB mRNA表達(dá)水平逐級(jí)升高[10]。在MM的血管新生過程中，JunB也起到關(guān)鍵作用，其可提高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A、VEGF-B、胰島素樣生長因子-1等促血管生長因子的表達(dá)，促進(jìn)MM血管新生，加速M(fèi)M進(jìn)展[14]。此外，JunB的異常表達(dá)也可通過影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的數(shù)量與功能參與MM骨病的發(fā)生[16]。由于按照Durie-Salmon分期，本研究中絕大部分患者為Ⅲ期，因此未分析JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平與Durie-Salmon分期之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，MM患者JunB mRNA表達(dá)水平與GLO水平呈正相關(guān)(r=0.320,P=0.044)，考慮JunB與漿細(xì)胞分泌GLO的能力有關(guān)。

c-Maf作為原癌基因，在MM細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附，并誘導(dǎo)對(duì)硼替佐米耐藥，同時(shí)其還可通過增加VEGF的產(chǎn)生促進(jìn)血管生成。10%～15%的MM患者出現(xiàn)t(14:16)染色體易位，可累及16q23區(qū)域的c-Maf，使c-Maf蛋白呈高表達(dá)。本研究中，MM患者c-Maf mRNA表達(dá)水平與GLO水平呈正相關(guān)(r=0.350,P=0.027)，與ALB水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.316,P=0.047)。盡管ALB是判斷MM分期的核心指標(biāo)，GLO水平的高低可反映漿細(xì)胞分泌單克隆免疫球蛋白的能力，但本研究未發(fā)現(xiàn)c-Maf mRNA表達(dá)水平與患者ISS分期有關(guān)[不同ISS分期患者c-Maf mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)]，考慮與本研究納入的MM患者集中分布在ISS Ⅱ、Ⅲ期，而ISSⅠ期患者數(shù)量較少，可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚，尚有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并分析Durie-Salmon分期與AP-1家族成員表達(dá)水平的相關(guān)性，以明確AP-1是否與MM患者的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)。

c-Fos在MM的骨病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。c-Fos對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)控作用。破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的NF-κB受體活化因子與其位于成骨細(xì)胞的配體結(jié)合，募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子，通過c-Jun氨基端激酶途徑誘導(dǎo)c-Jun/Fos活化，調(diào)節(jié)c-Fos的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體分化；同時(shí)還能通過NF-κB、蛋白激酶B途徑使c-Fos表達(dá)增加，c-Fos與活化的T細(xì)胞核因子c1結(jié)合，啟動(dòng)破骨細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體分化為成熟破骨細(xì)胞[22]。過表達(dá)c-Fos可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，而抑制c-Fos表達(dá)則會(huì)抑制破骨細(xì)胞分化[23]。c-Fos表達(dá)上調(diào)后可導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增加，骨吸收加強(qiáng)，血鈣水平升高。本研究中，MM患者c-Fos mRNA表達(dá)水平與血鈣水平呈正相關(guān)(r=0.317,P=0.046),提示MM患者隨著c-Fos mRNA表達(dá)水平升高，血鈣水平亦升高，說明c-Fos與溶骨程度相關(guān)，與上述研究結(jié)果相符。

c-Jun作為原癌基因，在多種實(shí)體腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[7]，然而在對(duì)MM的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，其起到抑制MM的作用，MM患者比健康者c-Jun/Fos活性降低；MM患者中，c-Jun低表達(dá)水平者比高表達(dá)水平者預(yù)后更差；誘導(dǎo)c-Jun表達(dá)可抑制MM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，因此，c-Jun對(duì)腫瘤可能起到雙向作用[16]。本研究未發(fā)現(xiàn)MM患者c-Jun mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)水平存在相關(guān)性，考慮可能與其作用的不確定性有關(guān)，c-Jun mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系有待進(jìn)一步深入挖掘。

綜上所述，AP-1家族成員JunB、c-Maf、c-Fos、c-Jun mRNA表達(dá)水平與MM患者性別、ISS分期無明顯關(guān)系；而JunB、c-Maf mRNA表達(dá)水平與患者蛋白合成能力相關(guān)，c-Fos mRNA表達(dá)水平與患者溶骨程度相關(guān)，JunB、c-Fos、c-Maf在MM的發(fā)病及疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮了一定作用，有望為今后MM的相關(guān)研究提供一定理論基礎(chǔ)。