整聯(lián)蛋白α5β1通過(guò)介導(dǎo)Gli1表達(dá)影響基底細(xì)胞癌的生長(zhǎng)與放療敏感性*

李錦意，黃小輝，范國(guó)雄

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院皮膚科，廣東惠州 516000

基底細(xì)胞癌(BCC)起源于表皮的最內(nèi)層或毛囊外根鞘，屬于源自基底細(xì)胞的常見(jiàn)惡性上皮腫瘤之一[1-2]。性別、年齡、紫外線輻射情況、吸煙史等都是BCC形成的影響因素[3]。BCC起病較為隱匿，因而易發(fā)生漏診，其治療后復(fù)發(fā)也極為常見(jiàn)。目前，藥物和手術(shù)治療BCC的效果欠佳[4]。放療在手術(shù)耐受能力差且年齡較大的BCC患者中被廣泛使用，然而，隨著腫瘤細(xì)胞對(duì)放療抵抗性的產(chǎn)生，需要增大照射劑量，但這一操作將會(huì)對(duì)正常組織造成嚴(yán)重?fù)p傷。整聯(lián)蛋白又稱為整合素，是一類黏附分子，屬于異源二聚體跨膜糖蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞環(huán)境之間的相互作用，在多種類型的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要包括腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等[5]。整聯(lián)蛋白α5β1作為整聯(lián)蛋白家族的重要成員之一，由β1和α5亞基的二聚化形成，已知其在多種腫瘤中高表達(dá)，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、侵襲、遷移及腫瘤血管生成[6-7]。Gli家族鋅指蛋白1(Gli1)是Hedgehog(Hh)信號(hào)通路遠(yuǎn)端的效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，Hh信號(hào)通路是多種生物學(xué)過(guò)程的重要介質(zhì)，包括胚胎發(fā)生、成體組織穩(wěn)態(tài)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展。研究表明，Gli1的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生等[8-9]。基于此，本研究檢測(cè)了α5β1在BCC中的表達(dá)情況，并探究其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與放療敏感性的影響及相關(guān)分子機(jī)制，旨在為以α5β1為靶點(diǎn)的BCC治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月本院皮膚科門診收治的32例BBC患者的皮膚BBC組織標(biāo)本為研究對(duì)象，標(biāo)本來(lái)源患者均經(jīng)臨床和病理檢查確診，其中男20例，女12例；年齡38～69歲，平均(51.40±5.16)歲。以同期32例行非腫瘤性皮瓣移植手術(shù)患者的正常皮膚組織標(biāo)本作為對(duì)照。對(duì)照標(biāo)本來(lái)源患者中男17例，女15例；年齡40～68歲，平均(54.35±5.32)歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療、光動(dòng)力及其他手段治療，并已排除合并其他類型腫瘤。所有患者對(duì)本研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 A431細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，Gli1抑制劑GANT61購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物有限公司，RNAiso Plus試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，聚偏氟乙烯(PVDF)膜和Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司，MTT試劑盒、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒及Hoechst 33258細(xì)胞凋亡染色試劑盒購(gòu)于上海貝博生物科技有限公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司，兔抗α5β1多克隆抗體、兔抗Gli1多克隆抗體、鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。重組慢病毒載體pLEX-MCS與pLEX-α5β1的構(gòu)建、包裝及滴度測(cè)定均由豐暉生物科技有限公司完成。其他實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。BB150-2TCS型細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，CX43型光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，C1Si型激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司，XSZ-220/20型X線深部治療機(jī)購(gòu)于丹東市康佳醫(yī)用機(jī)廠，iMark型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，DYY-16D型電泳系統(tǒng)購(gòu)于北京六一儀器廠，F(xiàn)ACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色 將皮膚BBC組織及正常皮膚組織標(biāo)本在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。切片脫蠟，加入檸檬酸緩沖液煮沸，在3%H2O2溶液中消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清室溫封閉。滴加兔抗α5β1多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加HRP標(biāo)記二抗(1∶1 000)，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，反復(fù)沖洗，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，干燥。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察染色情況并攝取圖片，α5β1陽(yáng)性表達(dá)多呈棕黃色至棕褐色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率與染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)定。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：<5%記0分，5%～25%記1分，>25%～50%記2分，>50%～75%記3分，>75%記4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。兩者分?jǐn)?shù)相加<2分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取A431細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照A組、pLEX-MCS組、pLEX-α5β1組、pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組。在各組A431細(xì)胞中添加含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞水平為4×105/mL，取100 μL接種于6孔板，分別將含pLEX-MCS和pLEX-α5β1的慢病毒液加入對(duì)應(yīng)組的細(xì)胞孔內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)設(shè)為50∶1。pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)添加100 μmol/L Gli1抑制劑GANT61。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，換用新鮮培養(yǎng)液，添加1 mg/L嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)α5β1的A431細(xì)胞系。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用RNAiso Plus試劑盒提取轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA純度與濃度。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算α5β1和Gli1的mRNA表達(dá)水平。α5β1上游引物：5′-CATCTTGGCATGCGCTCCA-3′，下游引物：5′-GTCTTGGTGAACTCGGCACT-3′；Gli1上游引物：5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′，下游引物：5′-GCCAGGGACACCTCCA-3′；β-actin上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot) 收集轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，在梳孔加入標(biāo)本，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，TBST緩沖液洗膜，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST緩沖液再洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析目的蛋白α5β1、Gli1蛋白表達(dá)水平。

1.3.5MTT法 收集轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞，每孔中加入20 μL MTT混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床振蕩至結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度(A)值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率=各組A值/對(duì)照孔A值×100%。

1.3.6EdU染色 收集轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞，調(diào)整水平后以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，加入10 μmol/L EdU進(jìn)行染色處理，PBS清洗，再用Apollo567避光孵育30 min，DAPI染料染核，洗滌后封片，干燥，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況并攝取圖片，紅色熒光為EdU陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)該視野下EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，兩者比值為EdU陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.3.7Hoechst 33258染色 收集轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，加入200 μL Hoechst 33258染色液，室溫避光孵育10 min，PBS再次清洗，滴加抗熒光猝滅劑封片，干燥，通過(guò)熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞凋亡情況并攝取圖片，細(xì)胞核呈藍(lán)色，熒光濃染顆粒為凋亡細(xì)胞。

1.3.8Transwell實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠鋪于24孔Transwell上室底部，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)凝膠。將轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞水平調(diào)整為2×104/mL，吸取200 μL移入Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝圖像，隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移檢測(cè)時(shí)在Transwell上室不鋪Matrigel膠，其余步驟均與上述步驟相同。

1.3.9細(xì)胞分組與放療處理 取A431細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照B組、4 Gy組、pLEX-α5β1+4 Gy組。對(duì)照B組細(xì)胞正常培養(yǎng)，4 Gy組細(xì)胞進(jìn)行4 Gy X射線照射，pLEX-α5β1+4 Gy組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染pLEX-α5β1慢病毒處理后采用4 Gy X射線照射。將細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔接種于6孔板，采用4 Gy X射線照射(6 mV射線垂直照射，劑量率為200 cGy/min，源皮距為100 cm)。在處理后培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性A值。

1.3.10流式細(xì)胞術(shù) 收集經(jīng)放療處理后的A431細(xì)胞，PBS清洗，胰酶消化，離心后用PBS將沉淀重懸于100 μL染料結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞水平為1×106/mL，取100 μL懸液移入干凈離心管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，渦旋混勻，室溫避光靜置20 min，隨后立即通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1皮膚BBC組織及正常皮膚組織α5β1表達(dá)情況比較 相較于正常皮膚組織，皮膚BBC組織內(nèi)有大量區(qū)域染色呈棕黃色至棕褐色，見(jiàn)圖1；皮膚BBC組織α5β1陽(yáng)性表達(dá)率為84.38%(27/32)，明顯高于正常皮膚組織的α5β1陽(yáng)性表達(dá)率[12.50%(4/32)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組A431細(xì)胞中α5β1與Gli1表達(dá)情況比較 與對(duì)照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組細(xì)胞中α5β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組α5β1 mRNA和蛋白表達(dá)水平與pLEX-α5β1組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2A、2B。pLEX-α5β1組細(xì)胞中Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照A組和pLEX-MCS組(P<0.05)；而與pLEX-α5β1組比較，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2C、2D。

注：A為正常皮膚組織；B為皮膚BBC組織。圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮膚BBC組織及正常皮膚組織中α5β1的表達(dá)(×200)

注：A為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的各組A431細(xì)胞中α5β1 mRNA表達(dá)水平比較；B為Western blot檢測(cè)的各組A431細(xì)胞中α5β1蛋白條帶圖及表達(dá)水平比較；C為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的各組A431細(xì)胞中Gli1 mRNA表達(dá)水平比較；D為Western blot檢測(cè)的各組A431細(xì)胞中Gli1蛋白條帶圖及表達(dá)水平比較；與對(duì)照A組比較，*P<0.05；與pLEX-MCS組比較，#P<0.05；與pLEX-α5β1組比較，△P<0.05。圖2 各組A431細(xì)胞中α5β1與Gli1表達(dá)情況比較

2.3各組A431細(xì)胞增殖能力比較 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)；與pLEX-α5β1組比較，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。EdU染色結(jié)果顯示，與對(duì)照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高(P<0.05)；與pLEX-α5β1組比較，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3B、3C。

2.4各組A431細(xì)胞凋亡形態(tài)檢測(cè)結(jié)果 Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，對(duì)照A組和pLEX-MCS組細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)較明顯的細(xì)胞核濃縮，可見(jiàn)深色熒光濃染顆粒，偶見(jiàn)細(xì)胞核碎裂；而pLEX-α5β1組細(xì)胞內(nèi)染色均勻，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)未發(fā)生濃縮；相較于pLEX-α5β1組，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組有細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象，呈深色熒光濃染，見(jiàn)圖4。

2.5各組A431細(xì)胞遷移與侵襲能力比較 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照A組和pLEX-MCS組比較，pLEX-α5β1組遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P<0.05)；而相較于pLEX-α5β1組，pLEX-α5β1+Gli1抑制劑組遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

注：A為MTT法檢測(cè)的各組A431細(xì)胞存活率比較；B為各組A431細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞率比較；C為EdU染色檢測(cè)各組A431細(xì)胞增殖活性圖(×100)；與對(duì)照A組比較，*P<0.05；與pLEX-MCS組比較，#P<0.05；與pLEX-α5β1組比較，△P<0.05。圖3 各組A431細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果

圖4 Hoechst 33258染色下各組A431細(xì)胞凋亡形態(tài)(×200)

2.6A431細(xì)胞對(duì)放療的敏感性 MTT法檢測(cè)各組A431細(xì)胞增殖活性變化，結(jié)果顯示，在處理后培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)，與對(duì)照B組比較，4 Gy組細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05)；而pLEX-α5β1+4 Gy組細(xì)胞增殖活性較4 Gy組明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)放療處理后細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，4 Gy組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照B組明顯升高(P<0.05)；pLEX-α5β1+4 Gy組細(xì)胞凋亡率較4 Gy組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組A431細(xì)胞增殖活性A值比較

注：A為顯微鏡下各組遷移細(xì)胞與侵襲細(xì)胞圖(×100)；B為各組遷移細(xì)胞數(shù)比較；C為各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較；與對(duì)照A組比較，*P<0.05；與pLEX-MCS組比較，#P<0.05；與pLEX-α5β1組比較，△P<0.05。圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組A431細(xì)胞的遷移與侵襲能力

注：A為各組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B為各組細(xì)胞凋亡率比較；與對(duì)照B組比較，*P<0.05；與4 Gy組比較，#P<0.05。圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A431細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

據(jù)報(bào)道，全球BCC的發(fā)病率在不斷增加，我國(guó)約70%的皮膚腫瘤為BCC[2]。BCC的治療方式可分為局部治療和全身治療，其中局部治療包括手術(shù)治療、冷凍療法、激光及藥物治療等，全身治療包括使用化療藥物維莫德吉、索尼德吉等在內(nèi)的方法。此外，光動(dòng)力治療和基因治療目前也被應(yīng)用到BCC的臨床治療中或已開(kāi)展了大量的實(shí)驗(yàn)研究[10]。雖然大多數(shù)早期BCC屬于低度惡性腫瘤，只發(fā)生局部病變且易于治療，但晚期BCC的治療方法仍然十分有限。目前，晚期BCC(包括轉(zhuǎn)移性BCC和局部難治性BCC)治療難度大，治療后5年復(fù)發(fā)率達(dá)20%，且患者預(yù)后不佳。因此，進(jìn)一步探索BCC的發(fā)病機(jī)制及與其發(fā)生相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并以此來(lái)尋找BCC治療的新型方案，是目前臨床研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。

整聯(lián)蛋白由兩個(gè)亞基組成，其中α亞基相對(duì)分子質(zhì)量為(120～170)×103，β亞基相對(duì)分子質(zhì)量為(90～100)×103。人體內(nèi)共有18個(gè)α亞基和8個(gè)β亞基，可以組裝成至少24種具有不同結(jié)合特性、組織分布和生物學(xué)功能的αβ整聯(lián)蛋白異二聚體，來(lái)充當(dāng)組織和器官特異性配體的受體。在這24種整聯(lián)蛋白亞型中，已發(fā)現(xiàn)多種亞型與腫瘤血管生成，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲有關(guān)，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性[6,11]。α5β1是唯一已知的α5整聯(lián)蛋白，作為跨膜蛋白其具有不同的結(jié)構(gòu)域，包括決定α5β1多種功能的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或其他細(xì)胞外配體結(jié)合，并有助于后續(xù)相關(guān)信號(hào)通路的功能發(fā)揮，而細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白相互作用以影響細(xì)胞遷移、侵襲和增殖。已有報(bào)道指出，α5β1與癌細(xì)胞的失巢凋亡抗性或藥物抗性有關(guān)[12-13]；此外，α5β1還與骨組織形成的維持和致動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的發(fā)生有關(guān)[14-15]。α5β1的多種功能表明其表達(dá)失調(diào)可能導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的多種疾病，目前研究已證實(shí)α5β1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)一些腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，如MITRA等[16]研究表明，纖連蛋白與α5β1的結(jié)合導(dǎo)致了α5整聯(lián)蛋白與c-Met直接結(jié)合(c-Met位于Src和FAK的上游)，α5β1通過(guò)該作用激活c-Met/FAK/Src依賴性信號(hào)通路，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；MOROZEVICH等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中，α5β1的高表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)的活性來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲及對(duì)多柔比星的抗性。本研究中，α5β1在皮膚BCC組織中異常表達(dá)，皮膚BBC組織α5β1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常皮膚組織(P<0.05)，進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A431細(xì)胞過(guò)表達(dá)α5β1后，細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力均提高，并抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

放療抵抗是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附性是腫瘤化療與放療反應(yīng)性的決定因素。目前，已有關(guān)于α5β1作為介導(dǎo)腫瘤放療敏感性的重要調(diào)節(jié)因子的報(bào)道，如DAMIANO等[18]在研究中指出，α5β1可促進(jìn)K562慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞與纖連蛋白結(jié)合，這種結(jié)合作用對(duì)化療藥物和γ輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均表現(xiàn)出一定的抵抗力；SHABANA等[19]研究表明，α5β1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過(guò)表達(dá)，PR_b是一種特異性靶向α5β1的纖連蛋白模擬肽，而含微小RNA(miR)-603的PR_b修飾的脂質(zhì)體復(fù)合物能夠明顯增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性，這意味著α5β1的高表達(dá)可能影響了腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。本研究結(jié)果顯示，α5β1在A431細(xì)胞中高表達(dá)降低了細(xì)胞對(duì)4 Gy X射線照射的敏感性，因此，靶向α5β1可能是提高腫瘤細(xì)胞放療敏感性的有效方法之一。

α5β1作為細(xì)胞表面受體發(fā)揮作用，能夠激活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路。以往研究表明，Hh信號(hào)通路可能與BCC的進(jìn)展有關(guān)，也是BCC發(fā)病機(jī)制啟動(dòng)的關(guān)鍵通路，Hh信號(hào)通路的異常激活導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)BCC發(fā)生的靶基因的組成型激活，其中包括Gli1[20-21]。BRENNAN-CRISPI等[22]報(bào)道指出，在痣樣基底細(xì)胞癌小鼠模型中橋粒鈣黏蛋白2(Dsg2)過(guò)表達(dá)，以自分泌和旁分泌方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)磷酸化并增加Gli1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)痣樣基底細(xì)胞癌發(fā)展。在本研究中，A431細(xì)胞高表達(dá)α5β1后其細(xì)胞內(nèi)Gli1 mRNA、蛋白的表達(dá)水平也明顯升高。GANT61是一種可滲透細(xì)胞的六氫嘧啶化合物，是Gli介導(dǎo)的基因反式激活的抑制劑，其已被證明在腫瘤細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和抗腫瘤干細(xì)胞活性的作用[23]。本研究使用Gli1抑制劑GANT61進(jìn)行處理后，A431細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力均顯著下降，由此推測(cè)，α5β1促進(jìn)BCC細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)作用可能與其介導(dǎo)的Gli1表達(dá)水平升高相關(guān)。

綜上所述，α5β1在BCC中異常高表達(dá)，其高表達(dá)可提高BCC細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)BCC細(xì)胞的遷移與侵襲，并降低其對(duì)放療的敏感性，該作用可能是通過(guò)介導(dǎo)Gli1表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，以整聯(lián)蛋白α5β1為靶點(diǎn)治療BCC可能是一種潛在策略，但α5β1是否通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平直接調(diào)控Gli1的表達(dá)，有待后續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究證實(shí)。