加味參芪地黃湯干預內質網(wǎng)應激輔助治療糖尿病腎病的療效及對腎功能、糖脂代謝的影響*

張良，王丹，金艷紅，趙大鵬，李秀典，韓玉生

（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院1.內科門診，2.腎內科，3.檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001；4.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 腎內科，黑龍江 哈爾濱 150040；5.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱150001）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎病的重要致病因素。既往調查顯示，我國糖尿病患病率＞10%，其中2 型糖尿病伴DN 患者占比接近40%[1]。形態(tài)學研究顯示，DN 患者腎小球高灌注狀態(tài)使細胞外基質堆積、系膜擴張、基底膜增厚，引發(fā)腎小管纖維化、腎小球硬化并伴結節(jié)性系膜病變，最終導致蛋白尿等嚴重腎功能損傷，需要依靠定期透析維持生命[2]。大量研究顯示，內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress,ERS）通過調控多條未折疊蛋白反應信號通路，觸發(fā)自身免疫應答，促進DN 的發(fā)生、發(fā)展，可作為防治DN 的新靶點[3-4]。目前臨床多通過抑制患者體內腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻止蛋白尿，以保護腎功能為主要治療思路。但DN 患者多合并多種慢性疾病，因此單純西藥治療的臨床效果并不十分理想[5]。隨著中西醫(yī)結合治療不斷發(fā)展，有臨床研究指出，中藥在DN 防治中具有一定的優(yōu)勢。本文通過聯(lián)合加味參芪地黃湯輔助治療DN，觀察其臨床效果，并探究其對ERS的干預機制，期望為臨床防治DN提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年6 月—2021 年10 月黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院腎內科收治的DN 患者126例為研究對象，根據(jù)患者對治療方案的選擇分為研究組（79例）和對照組（47例）。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合《中國2 型糖尿病防治指南（2013 年版）》[6]診斷標準：有明確糖尿病病史；隨機尿白蛋白/肌酐比值＞30 mg/g，或腎小球濾過率＜60 mL/（min·1.73 m2）3 個月以上，或腎穿刺活檢符合DN 病理改變；②中醫(yī)辨證符合《中醫(yī)內科學》[7]診斷標準，主癥：脾腎陰虛兼有氣虛，陰津虧耗、煩渴多飲、自汗盜汗、尿頻、消瘦；次癥：面色晄白，失眠心煩、舌質紅少津，苔少或花剝、脈數(shù)（細數(shù)或濡）；③患者及家屬知情并同意。

1.2.2 排除標準①合并嚴重的心、腦、肺及造血系統(tǒng)的嚴重疾??；②合并嚴重的腫瘤、肝腎功能不全、藥源性蛋白尿等疾??；③合并嚴重精神疾?。虎苋焉锘虿溉槠趮D女；⑤基礎資料不全或依從性差；⑥對本研究使用藥物過敏。

1.3 治療方法

所有入組患者控制蛋白質及糖類攝入，戒煙、戒酒、控制體重，飲食及能量攝入?yún)⒖肌短悄虿∧I病防治專家共識（2014 年版）》[8]相關標準。對照組患者給予以格列美脲[賽諾菲（北京）制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20057672] 2 mg/d，聯(lián)合伏格列波糖片（蘇州中化藥品工業(yè)有限公司，國藥準字H20093758）0.2 mg/次，三餐嚼服。研究組在上述基礎上聯(lián)合使用加味參芪地黃湯：黨參15 g、黃芪20 g、熟地15 g、山藥15 g、茯苓20 g、丹皮15 g、山茱萸15 g，生姜3 g、大棗5枚，每日2 次水煎劑，每劑50 mL，21 d為1 個療程。若患者有其他輔癥，則在基礎方劑上酌情加減。兩組患者均口服藥物治療5 個療程。

1.4 qRT-PCR檢測ERS相關指標

所有入組患者禁食8 h后，采集治療前及治療周期結束后（相對同一時間）次日清晨空腹靜脈血5 mL，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）（PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：Quant Studio 3）分別檢測人內質網(wǎng)應激相關蛋白（human endoplasmic reticulum stress-related protein,CHOP）、活化轉錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）、分子伴侶葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78 ku,GRP78）mRNA 的表達。將采集的血液標本1 000 r/min 離心5 min 分離血漿，低溫保存待測。樣本加入TRIzol 提取總RNA 試劑盒（哈爾濱新海基因檢測有限公司，批號：B0132），并采用NanoDrop ND-1000 定量樣本中總RNA 質量。總RNA 逆轉錄為cDNA（RT Master Mix for qPCR Ⅱ試劑盒購自美國Med Chem Express 公司），采用Primer Premier 5.0 軟件并根據(jù)目標miRNA 設計引物（內參U6），引物序列見表2。將配置好的PCR 反應溶液置于Real time PCR 儀上擴增（Power SYBR green 試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司）。反應條件：93℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min。根據(jù)擴增曲線及熔解曲線判斷qRT-PCR 反應質量，以2-ΔΔCt值為目的基因相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

1.5 檢測血脂、血糖、腎功能等指標

采集所有入組患者治療前及治療周期結束后（相對同一時間）清晨靜脈血5 mL，采用全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司，AU5800）檢測血脂四項：甘油三酯（Triglyceride,TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）；腎功能四項：血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、白蛋白（Albumin,Alb）、24 h 尿蛋白定量；血糖四項：空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、餐 后2 小時血糖（2 h postprandial blood glucose,2 hPBG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）、空腹胰島素（fasting insulin,FINS）。計算穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)（homeostasis modeall assessment of insulin resistance,HOMA-IR），HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血管緊張素（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）及血清Caspase-12 水平；觀察入組患者治療后不良反應發(fā)生情況。

1.6 療效診斷標準

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[9]和《糖尿病及其并發(fā)癥中西醫(yī)診治學》[10]療效評判標準。①顯效：臨床癥狀基本消失，24 h 尿蛋白定量下降2/3 以上，Scr 下降1/4 以上；②有效：臨床癥狀及腎功能明顯改善（未及顯效標準），24 h 尿蛋白定量下降1/3 以上；③無效：臨床癥狀及腎功能未恢復或有加重傾向，各生化指標均未達標。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療前后血糖指標的變化

兩組治療前后血糖指標的差值比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究組HbA1c、FBG、2 hPBG、FINS、HOMA-IR 的差值大于對照組。見表3。

表3 兩組患者治療前后血糖指標的差值比較（）

表3 兩組患者治療前后血糖指標的差值比較（）

2.2 兩組患者治療前后血脂指標的變化

兩組治療前后血脂指標的差值比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究組TG、TC、LDL-C、HDL-C 的差值大于對照組。見表4。

表4 兩組患者治療前后血脂指標的差值比較（mmol/L，）

表4 兩組患者治療前后血脂指標的差值比較（mmol/L，）

2.3 兩組患者治療前后腎功能指標的變化

兩組治療前后腎功能指標的差值比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究組Scr、BUN、Alb、24 h 尿蛋白定量的差值大于對照組。見表5。

表5 兩組患者治療前后腎功能指標的差值比較（）

表5 兩組患者治療前后腎功能指標的差值比較（）

2.4 兩組患者治療前后ERS指標的變化

兩組治療前后ERS 指標的差值比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究組CHOP mRNA、ATF6 mRNA、GRP78 mRNA、AngⅡ、血清Caspase-12 的差值均大于對照組。見表6。

表6 兩組患者治療前后ERS指標的差值比較（）

表6 兩組患者治療前后ERS指標的差值比較（）

2.5 兩組患者臨床療效比較

研究組總有效率為87.34%，對照組為68.09%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.877，P=0.032），研究組高于對照組。見表7。

表7 兩組患者臨床療效比較例（%）

2.6 兩組患者不良反應發(fā)生情況比較

研究組不良反應總發(fā)生率為7.59%，對照組為27.66%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.065，P=0.005），研究組低于對照組。見表8。

表8 兩組患者不良反應發(fā)生情況比較例（%）

3 討論

一項全國橫斷面調查結果顯示，我國成年男性糖尿病發(fā)病率為11.7%，女性為10.2%，40 歲以下患病率＞6%，總例數(shù)超過1億[11]。隨著糖尿病病例數(shù)的不斷攀升，其防治工作任重道遠。近年來隨著中醫(yī)技術不斷發(fā)展，中西醫(yī)結合在臨床治療中得到廣泛應用。傳統(tǒng)醫(yī)學對DN 并無記載，而多數(shù)學者將其歸類為“消渴癥”。中醫(yī)認為其病機為脾腎虧虛、腎精不封，水谷失于統(tǒng)攝，氣化不利，濁濕內蘊，繼而表現(xiàn)出身體消瘦或浮腫。而汪偉杜等[12]認為，DN 應由厥陰風動、疏泄太過所致。其研究指出，三焦之油膜發(fā)于腎，敷部其中元氣，通調水道；DN 患者因脾腎虧虛，以致中焦（膜）通道不疏，水火不濟，火性上炎，風火相煽，則表現(xiàn)出上焦口燥欲飲，下焦虛寒尿頻，使疾病整體呈現(xiàn)出寒熱虛實夾雜的特征[12]。現(xiàn)代中醫(yī)研究指出，焦膜與內質網(wǎng)在功能及結構上極為相似。

內質網(wǎng)是胞內囊腔、泡狀、管狀等結構的連續(xù)網(wǎng)膜系統(tǒng)，真核細胞≥1/3 的蛋白質均在內質網(wǎng)中合成、折疊、組裝及運輸，同時其通過監(jiān)測細胞器內蛋白質的合成及降解過程，調節(jié)蛋白質穩(wěn)態(tài)，保證胞內正常的生理功能[13-14]。在機體處于缺血、缺氧、氧化應激、內質網(wǎng)內鈣過量等多種病理環(huán)境下，均可打破內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，發(fā)生ERS 反應；ERS 通過激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response,UPR）等多條信號通路，啟動細胞保護機制，維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。然而長時間、高強度刺激UPR，可激活細胞損傷機制，引發(fā)細胞凋亡，導致疾病的發(fā)生、發(fā)展[15]。有研究指出，UPR 信號通路受GRP78、肌醇需求酶1、雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶及ATF6 共同介導[16]。正常機體狀態(tài)下，上述4 個蛋白共同結合，處于失活穩(wěn)態(tài)；當ERS 被過度/持續(xù)刺激后，促凋亡轉錄因子CHOP、血清Caspase-12 等被激活，進而啟動細胞凋亡程序[17]。有文獻顯示，高血糖、蛋白尿，以及晚期糖基化終產(chǎn)物、游離脂肪酸的增加均可激化ERS，觸發(fā)腎臟細胞內UPR信號通路[18]?；A研究證實，與非糖尿病db/m小鼠比較，db/db 小鼠腎皮質中CHOP、Caspase-12 表達顯著上調[19]。另有研究指出，血管緊張素Ⅱ可通過誘導ERS 反應蛋白GRP78、CHOP 等的表達，調控多條信號通路，促進細胞凋亡，加重腎小球內皮細胞損傷。因此，近年來大量學者認為，針對ERS 靶點進行干預，或可成為治療DN 的新方法。本研究結果與上述研究基本一致，提示通過降低刺激ERS反應的相關基因與蛋白的表達，抑制UPR 啟動細胞凋亡程序，可降低機體損傷。

隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入，在西藥單靶點、一對一的基礎上，中醫(yī)藥臨床呈現(xiàn)出的整體辨證治療、多層次、多靶點、多途徑的輔助優(yōu)勢，得到臨床醫(yī)師廣泛肯定。本研究采用的參芪地黃湯，功在補脾腎，益氣養(yǎng)陰?，F(xiàn)代藥理證實，黨參能夠顯著增強網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)及消化系統(tǒng)功能，促進白蛋白、血紅蛋白等合成，提高免疫力；黃芪可雙向調節(jié)血壓及糖代謝，維持血壓、血糖平衡，同時促進脾臟內粗面內質網(wǎng)增生，保護腎小球基底膜電荷屏障及機械屏障，增強蛋白合成率，提高血漿白蛋白水平，減少蛋白尿[20]；山藥可促進胰島素分泌，改善受損胰島B 細胞，并清除體內自由基，降低對ERS 的激活風險[21]；丹皮可改善機體微循環(huán)，促進肝腎組織細胞修復及再生；山茱萸可調節(jié)糖脂代謝，抗氧化、增強機體免疫力。諸藥合用，可促進肝、腎內皮修復，平衡糖脂代謝，促進腸胃消化吸收，消除蛋白尿，改善肝腎及整個機體功能。李春芳等[22]研究表示，參芪地黃湯可明顯改善2型糖尿病大鼠腎功能及腎臟病變，降低血清AngⅡ和腎組織內皮素水平，對腎臟有保護作用。朱勤等[23]研究結果則顯示，參芪地黃湯可保護阿霉素腎病大鼠Nephrin 蛋白表達，保護腎臟，減少蛋白尿。本研究結果顯示，研究組各指標的改善均明顯優(yōu)于單純西藥治療的對照組，且總有效率更高，而不良反應更低。這在一定程度上說明，聯(lián)合用藥的治療方案可有效改善患者糖脂代謝，提高腎功能，對ERS 誘發(fā)的細胞凋亡程序具有明顯的抑制作用。

綜上所述，聯(lián)合加味參芪地黃湯對糖尿病腎病患者的臨床癥狀的改善、糖脂代謝及腎功能恢復效果更優(yōu)，更有利于降低西藥治療帶來的不良反應，值得臨床推廣應用。