妊娠期糖尿病患者血清microRNA-122、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及與圍生兒結(jié)局的關(guān)系*

楊雅嵋，張程舉，胡灝懿，劉勝鳳，冉偉

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 南充 637002；2.南充市中醫(yī)醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 南充 637000）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus,GDM）會(huì)使胎盤基底膜、胎盤的細(xì)胞功能及其細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生改變，影響胎盤生長(zhǎng)，導(dǎo)致胎兒營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸與吸收障礙，進(jìn)一步造成胎兒生長(zhǎng)發(fā)育異常[1]。目前GDM 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制有拮抗胰島素激素水平升高、胰島素對(duì)抗等[2]。近年來，有學(xué)者提出GDM 與2 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制相似[3]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）主要通過增加血管通透性參與糖尿病發(fā)病機(jī)制，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)及促進(jìn)該基因的有絲分裂，誘導(dǎo)新血管生成[4]。VEGF 在糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的血管改變中均起重要作用[5]。調(diào)控基因表達(dá)主要分為mRNA 翻譯為蛋白質(zhì)和調(diào)控DNA 的轉(zhuǎn)錄過程，前者為非編碼RNA 的調(diào)控，以microRNA（miRNA）最受關(guān)注[6]。越來越多研究證實(shí)，miRNA 能夠調(diào)控血糖的代謝過程，不過有關(guān)miR-122 在糖尿病的表達(dá)研究較少。本研究目的在于探討miR-122、VEGF 是否參與GDM 病理的改變，并分析兩者對(duì)GDM 患者圍生兒結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年5 月—2020 年1 月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的GDM 患者80例作為研究組。其中，初產(chǎn)婦52例，經(jīng)產(chǎn)婦28例；年齡20～38歲，平 均（29.36±4.12）歲；孕 周31～39周，平 均（35.20±1.36）周。另選取同期在本院產(chǎn)檢的健康妊娠女性70例作為對(duì)照組。其中，初產(chǎn)婦45例，經(jīng)產(chǎn)婦25例；年齡20～37歲，平均（29.03±4.07）歲；孕周30～39周，平均（35.07±1.18）周。研究組中胎膜早破3例，胎兒窘迫4例，早產(chǎn)4例，將患者分為不良組與良好組，分別有11例和69例。兩組分娩經(jīng)歷、年齡、孕周等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究屬于前瞻性研究，且符合《赫爾辛基宣言》[8]。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②為妊娠期首次診斷；③無其他妊娠合并癥；④入組近1 周內(nèi)未使用過糖代謝藥物；⑤已簽署研究知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①胎兒唐氏綜合征；②胎兒心臟發(fā)育異常；③胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限或畸形。

1.3 方法

1.3.1 血糖及VEGF 水平檢測(cè)抽取受試者2 mL靜脈血，采用GLM-77 型血糖分析儀（上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)儀器發(fā)展有限公司）測(cè)定患者空腹血糖（fasting blood glucose,FGB）、餐后2小時(shí)血糖（2 hour postprandial blood glucose,2 hPG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）；另抽取受試者靜脈血3～4 mL，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，采用IAMMGE 特定蛋白分析儀（美國貝克曼公司）行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定VEGF。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)miR-122 表達(dá)采集受試者外周靜脈血3～4 mL，3 000 r/min 離心5 min，取血清，置于混凝管中，加入miRNA Extractor 混勻分裝至EP管，置入-70℃冰箱冷凍保存。提取miRNA，取出樣本室溫下放置5～10 min，完全分離核酸與核蛋白，加入氯仿0.2 mL，震蕩30 s，12 000 r/min 離心15 min，吸取上層水相置于新的EP 管中，加入1/3 倍無水乙醇混勻，加入吸附柱中，12 000 r/min 離心10 min，收集穿流液到新的EP 管中，加入2/3 倍無水乙醇混勻，將全部溶液用轉(zhuǎn)液器加入吸附柱中，7 500 r/min 離心5 min，倒掉收集管中的廢液。再將吸附柱放回收集管，12 000 r/min 離心2 min，倒掉收集管中的廢液，再重復(fù)1 次。最后將吸附柱放回收集管，12 000 r/min離心2 min，置入新的EP管中，加入30 μL RNase-free水，12 000 r/min 離心2 min，棄吸附柱，保留流出液。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，離心管中加入各種反應(yīng)成分，混勻12 000r/min 離心3～5 s，反應(yīng)混合物應(yīng)用TPfofessional Standard PCR 儀（德國Biometra公司）37℃溫浴60 min，85℃加熱5 min，使酶失活。qRT-PCR 反應(yīng)中miR-122 的引物序列，正向引 物：5'-GCGGTCGACATGGTGGAATGTGGAGGTGA AG-3'，反向引物：5'-GGAATTCAAAAAAGATTGAG AAGACTGATATC-3'，均130bp。獲得cDNA樣本后，4℃保存。加入相應(yīng)的樣本、試劑，加樣，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)體系操作。數(shù)據(jù)采集應(yīng)用2-ΔΔCt法。

1.3.3 隨訪自研究組在本院確診妊娠期糖尿病開始，以電話、微信、短信的形式進(jìn)行隨訪，直至其結(jié)束妊娠。若參與者中途轉(zhuǎn)至其他醫(yī)院產(chǎn)檢，則隨訪終止。統(tǒng)計(jì)研究組胎膜早破、胎兒窘迫、早產(chǎn)等不良圍生兒結(jié)局的發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血糖水平比較

兩組血糖水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組高于對(duì)照組。見表1。

表1 兩組血糖水平比較（）

表1 兩組血糖水平比較（）

2.2 兩組miR-122、VEGF比較

兩組miR-122、VEGF 比較，t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組miR-122、VEGF比較（）

表2 兩組miR-122、VEGF比較（）

2.3 GDM患者miR-122、VEGF與血糖的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GDM 患者miR-122 與FGB、2hPG和HbA1c呈正相關(guān)（r=0.605、0.752 和0.542，均P=0.000），VEGF與FGB、2hPG和HbA1c呈正相關(guān)（r=0.532、0.623 和0.596，均P=0.000）。

2.4 不良組與良好組miR-122、VEGF比較

兩組miR-122、VEGF 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不良組高于良好組。見表3。

表3 不良組與良好組miR-122、VEGF比較（）

表3 不良組與良好組miR-122、VEGF比較（）

2.5 ROC曲線分析

ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-122、VEGF 及兩者聯(lián)合檢測(cè)GDM 患者不良圍產(chǎn)兒結(jié)局的AUC 分別為0.787（95% CI：0.687，0.887）、0.755（95% CI：0.658，0.851）、0.842（95% CI：0.760，0.923）。miR-122 診斷GDM 患者不良圍生兒結(jié)局的敏感性、特異性為0.822（95% CI：0.792，0.911）和0.615（95% CI：0.560，0.741），VEGF 診斷GDM 患者不良圍生兒結(jié)局的敏感性、特異性為0.778（95% CI：0.645，0.874）和0.446（95% CI：0.382，0.576），兩者聯(lián)合檢測(cè)診斷GDM 患者不良圍生兒結(jié)局的敏感性、特異性為0.867（95% CI：0.802，0.937）和0.569（95% CI：0.464，0.664）。見表4 和圖1。

圖1 miR-122、VEGF及兩者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)GDM患者不良衛(wèi)生兒結(jié)局的ROC曲線

表4 miR-122、VEGF及兩者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)GDM患者不良衛(wèi)生兒結(jié)局的ROC曲線參數(shù)

3 討論

女性妊娠期間隨孕周的增加，體內(nèi)胎盤泌乳素、孕激素、催乳素等拮抗胰島素激素水平會(huì)顯著升高，使得胰島素敏感性降低。正常情況下，機(jī)體為維持正常的血糖代謝，會(huì)不斷分泌胰島素，而GDM 患者胰島素分泌受限無法完成代償，便會(huì)造成體內(nèi)血糖水平升高[9]。血糖的病理改變雖然不會(huì)給胎盤帶來特異性結(jié)構(gòu)的改變，但會(huì)影響許多形態(tài)上的變化，如胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層增生、絨毛小動(dòng)脈增生、小血管管腔狹窄、滋養(yǎng)層基底膜變厚等，同時(shí)絨毛毛細(xì)血管過度充盈、毛細(xì)血管擴(kuò)張，這一系列的變化是造成胎盤慢性缺氧及新生兒窒息、胎膜早破、胎兒窘迫等新生兒不良結(jié)局的主要原因[10]。此外，血糖的升高會(huì)使膽酸含量增多，引發(fā)肝內(nèi)膽汁淤積癥，提高子宮前列腺素水平，刺激子宮平滑肌催產(chǎn)素受體，引發(fā)嚴(yán)重宮縮，造成早產(chǎn)[11]。MUCHE等[12]研究指出，GDM 會(huì)增加新生兒不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。因此，早期及時(shí)診斷GDM，采取救治措施對(duì)改善母嬰結(jié)局十分重要。

GDM 的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的生存內(nèi)環(huán)境遭到破壞，細(xì)胞功能發(fā)生適應(yīng)性改變，可誘導(dǎo)胎盤組織凋亡[13-14]。這一過程與胎盤組織的血供有密不可分的關(guān)系，而VEGF 因子是目前已知最強(qiáng)的血管生成因子之一。本研究結(jié)果顯示，研究組VEGF 水平高于對(duì)照組，初步推測(cè)血清VEGF 異常表達(dá)可能與GDM有關(guān)。分析原因可能在于：①胎盤血管密布及胎盤床血管內(nèi)皮損傷，可造成其血液灌注不足，血管活性物質(zhì)分泌失衡，最終會(huì)引起胎盤血氧供應(yīng)缺失[15]；高血糖狀態(tài)下細(xì)胞無氧酵解增強(qiáng)，為適應(yīng)高糖環(huán)境，糖酵解相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致胎盤微血管的慢性缺氧[16]；③胎盤血管壁變厚，管腔狹窄，絨毛或部分絨毛發(fā)育不成熟，且絨毛毛細(xì)血管過分充盈，毛細(xì)血管擴(kuò)張，從而導(dǎo)致胎盤微血管的慢性缺氧[17]。以上過程均會(huì)導(dǎo)致VEGF 表達(dá)異常升高，造成胎盤形成障礙，是引發(fā)早產(chǎn)及流產(chǎn)的重要原因。

miRNA 可以與靶基因mRNA3'端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在翻譯水平或轉(zhuǎn)錄后參與基因的表達(dá)調(diào)控。如今miRNA 在高血脂、糖尿病等多種代謝疾病中的作用逐漸受到關(guān)注。ZHU等[18]在妊娠期糖尿病患者基因中獲得了184 個(gè)低miRNA 靶向上調(diào)基因和234 個(gè)高miRNA 靶向下調(diào)基因，另有67 個(gè)上調(diào)基因和48 個(gè)下調(diào)基因受到miRNA 異常交替的調(diào)控。DENG等[19]研 究指出，GDM 患者血清miR-29a/b 表達(dá)下調(diào)。ANJA等[20]研究指出，血清miR-16、miR-29a 和miR-134 在GDM 患者中呈高表達(dá)。禤文婷等[21]體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，軟脂酸誘導(dǎo)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，miR-122 表達(dá)顯著上調(diào)，原因?yàn)閙iR-122 可通過下調(diào)AMPK基因表達(dá)，進(jìn)一步加重胰島素抵抗程度。本研究結(jié)果顯示，研究組血清miR-122 表達(dá)高于對(duì)照組，提示GDM 患者miR-122 表達(dá)異?？赡芘c胰島素抵抗有關(guān)。主要機(jī)制是通過上調(diào)二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2 基因和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1基因調(diào)節(jié)脂肪酸、低密度脂蛋白受體和膽固醇合成途徑，并催化甘油三酯類合成，從而參與胰島素抵抗調(diào)節(jié)。但也有研究得出不一樣的結(jié)論，F(xiàn)ORNES等[22]研究顯示，miR-122 的表達(dá)在妊娠期糖尿病大鼠及其雄性胎兒的血漿中下調(diào)，且miR-122 水平可通過體外過氧化物酶體增殖物激活受體γ 活化和體內(nèi)富含過氧化物酶體增殖物激活受體配體的母體飲食進(jìn)行調(diào)節(jié)。鑒于miR-122 在GDM 患者中表達(dá)的相關(guān)研究較少，此結(jié)果還需日后擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)范圍進(jìn)一步獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

綜上所述，GDM 患者血清miR-122、VEGF 均存在表達(dá)失調(diào)，兩者與血糖呈正相關(guān)，且兩者聯(lián)合檢測(cè)可有效預(yù)測(cè)不良圍生兒結(jié)局的發(fā)生。