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    基于MALDI-TOF MS技術(shù)快速檢測產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌

    2022-12-14 07:47:20陳楷黃志深曾羲雷燕林秀敏蔣佳希陳賢馳肖劍
    現(xiàn)代食品科技 2022年11期
    關(guān)鍵詞:蠟樣芽胞響應(yīng)值

    陳楷,黃志深,曾羲,雷燕,林秀敏,蔣佳希,陳賢馳,肖劍

    (廣州市食品檢驗所,廣東廣州 511400)

    蠟樣芽胞桿菌作為食品中重要防控的致病菌之一,也是食源性疾病中常見的條件致病菌。研究發(fā)現(xiàn),蠟樣芽胞桿菌在即食肉制品、乳制品及各種生鮮食品中均有一定的檢出率,其中最為典型的是米面制品,作為主要污染源的濕粉類食品,蠟樣芽胞桿菌檢出率達到43.17%[1]。據(jù)統(tǒng)計,環(huán)境中的蠟樣芽胞桿菌僅有1%~2%的菌株會產(chǎn)生嘔吐毒素[2],但在食品和臨床樣品中產(chǎn)嘔吐毒素菌株的流行率卻高達32.8%[3]。

    蠟樣芽胞桿菌嘔吐毒素(Cereulide,以下簡稱嘔吐毒素)的結(jié)構(gòu)為[D-O-Leu-D-Ala-D-O-Val-D-Val]3,如圖1,是一種十二環(huán)形多肽,分子量為1,153.38 u[4,5],由位于巨質(zhì)粒上的ces基因簇(Cereulide Synthetase Gene Cluster)編碼的非核糖體肽合成酶(Networked Robot Perceptual System,NRPS)合成的,該毒素由攜帶ces基因的菌株在食物中預先產(chǎn)生且非常穩(wěn)定,進入人體后在胃中與其受體結(jié)合,導致嘔吐反應(yīng)[6]。目前,國內(nèi)蠟樣芽胞桿菌的檢測方法是GB 4789.14-2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》[7],該方法只進行蠟樣芽胞桿菌的鑒定,無法區(qū)分菌株是否產(chǎn)嘔吐毒素,而區(qū)分該菌株的方法通常用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)檢測[8],通過檢測菌株是否攜帶ces基因進行辨別,但無法確定嘔吐毒素是否產(chǎn)生,要測定嘔吐毒素生成量還需通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等儀器進行檢測[9],前處理復雜、基質(zhì)效應(yīng)大?;|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)被廣泛運用于微生物鑒定,該技術(shù)通過高度復雜的統(tǒng)計軟件自動生成實驗結(jié)果,具有快速便捷、操作相對簡單、運行成本低等特點[10]。目前,Ulrich 等[11]通過MALDI-TOFMS 測量700~3 500 u 質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白,確定了嘔吐毒素的兩個特定生物特征峰分別為m/z1 171 和m/z1,187,Doellinger 等[12]在MALDI-TOF MS 反射模式下測得嘔吐毒素的鈉和鉀加合物信號峰為m/z1 175([M+Na]+)和m/z1 191([M+K]+),MALDI-TOF MS 在檢測產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌方面的潛力得到了檢驗。

    圖1 嘔吐毒素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of cereulide

    但由于嘔吐毒素的合成不僅受細菌內(nèi)部基因的調(diào)控,還受所在環(huán)境因素的影響,研究顯示,蠟樣芽胞桿菌合成嘔吐毒素的最適溫度為20~30 ℃[13]。此外,營養(yǎng)條件、pH 值、濕度和NaCl 等也會影響嘔吐毒素的產(chǎn)生[14,15]。為此,本研究通過對嘔吐毒素標準品進行分析,對特征峰進行定位并測定其靈敏度,評估國內(nèi)常用于培養(yǎng)蠟樣芽胞桿菌不同培養(yǎng)基和其他條件之間檢測結(jié)果的差別,優(yōu)化實驗方案,并采用已確定含有ces基因型的蠟樣芽胞桿菌菌株進行方法特異性驗證,建立一種能簡單、快速、高通量直接進行產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的鑒別方法,為食品中病原微生物靶標性監(jiān)測和食品安全事件應(yīng)急檢驗提供一種快捷鑒別技術(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗用菌株

    蠟樣芽胞桿菌標準菌株(CICC 10352)、蕈狀芽胞桿菌標準菌株(CICC 21473),來自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC);蘇云金芽胞桿菌標準菌株(ATCC 10792),來自于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;49 株野生蠟樣芽胞桿菌菌株[16](編號BC-1~49,其中BC-43、49 攜帶ces基因,實驗室分離)。

    1.1.2 主要試劑

    嘔吐毒素標準品,荷蘭Chiralix 公司;甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂(Mannitol Yolk Polymyxin Agar Base,MYP)、胰酪胨大豆羊血瓊脂平板(Trypticase Soy Sheep Blood Agar Plate,TSSB)、胰酪大豆胨瓊脂(Tryptic Soytone Agar,TSA),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;乙腈(色譜純),德國Meker 公司;甲酸(色譜純),美國Fisher Scientific 公司;三氟乙酸(色譜純),美國Sigma-Aldrich 公司;α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)、Bacterial Test Standard,德國Bruker 公司。

    1.2 主要儀器設(shè)備

    基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(Ultrafle Xtreme),德國Bruker 公司;生化培養(yǎng)箱,賓德環(huán)境試驗設(shè)備(上海)有限公司;生物安全柜,賽默飛世爾(上海)有限公司;高壓滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 嘔吐毒素標準品的檢測

    將嘔吐毒素標準品(2 mg)用純乙腈溶解后定容至200 μg/mL 制成標準儲備液,用φ=75%乙醇進行梯度稀釋,分別制備10、5、1、0.1、0.01 μg/mL 的稀釋液,從這些稀釋液中分別吸取1 μL 至MTP 384 靶板上,在室溫下風干,覆蓋1 μL 基質(zhì)HCCA,待基質(zhì)干燥后進行MALDI-TOF MS 檢測。

    1.3.2 不同培養(yǎng)條件菌株的檢測

    依據(jù)GB 4789.14[7]中蠟樣芽胞桿菌分離鑒定使用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度,將攜帶ces基因的蠟樣芽胞桿菌菌株分別接種到TSA、TSSB 和MYP 三種培養(yǎng)基平板,并將每種培養(yǎng)基平板分別放置于30 ℃和36 ℃條件下進行培養(yǎng),分別培養(yǎng)12、18、24 和48 h 后用1 μL的一次性接種環(huán)直接從培養(yǎng)基中挑取典型菌落,均勻的涂抹到MTP 384 靶板上,用1 μL 體積分數(shù)70%甲酸覆蓋菌苔,在室溫下風干,再覆蓋1 μL 基質(zhì)HCCA,待基質(zhì)干燥后上機進行MALDI-TOF MS 檢測。

    根據(jù)試驗要求,試驗指標為特征峰的響應(yīng)值,不考慮交互作用,試驗因素水平如表1,其中因素A 為四水平,而因素B、C 由于受試驗條件的限制,分別只取二水平和三水平,為此把因素B 虛擬二個水平,因素C 虛擬一個水平,虛擬結(jié)果相當于把L16(43)表2作了改造,第2 列為1→1,2→2,3→1,4→2,第三列為1→1,2→2,3→3,4→1,通過正交試驗對結(jié)果進行極差分析。

    表1 因素水平表Table 1 Factor level table

    表2 試驗方案Table 2 Test scheme

    1.3.3 方法特異性檢驗

    將實驗室現(xiàn)有的49 株蠟樣芽胞桿菌野生菌株(其中2 株含ces基因)和標準菌株蠟樣芽胞桿菌(CICC 10352)、蕈狀芽胞桿菌(CICC21473)、蘇云金芽胞桿菌(ATCC10792),使用1.3.2 的最優(yōu)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后,用1 μL 的一次性接種環(huán)直接從培養(yǎng)基中挑取典型菌落,均勻的涂抹到MTP 384 靶板上,用1 μLφ=70%甲酸覆蓋菌苔,在室溫下風干,再覆蓋1 μL 基質(zhì)HCCA,待基質(zhì)干燥后上機進行MALDITOF MS 檢測。

    1.3.4 質(zhì)譜條件

    正離子反射模式;檢測范圍:700~3 500 u;激光強度:30%;激光點擊數(shù):每圖譜200 次(8 次激光累積);激光頻率;2 000.0 Hz;離子源加速電壓:20 kV;采用速率:5.00 GS/s。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    1.4.1K值和k值的計算

    以第一列A 因素為例:

    K1=x3+x5+x8+x15

    K2=x1+x7+x10+x14

    K3=x4+x6+x11+x16

    K4=x2+x9+x12+x13

    ki=

    式中:

    Ki——各因素同一水平之和;

    i——第i個水平;

    ki——各因素同一水平的平均值;

    n——該水平的總試驗數(shù)。

    1.4.2 極差R的計算

    R=max(ki)-min(ki)

    式中:

    R——該因素在其取值范圍內(nèi)試驗指標變化的幅度。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 嘔吐毒素標準品的檢測結(jié)果

    分別吸取1 μL 質(zhì)量濃度為10、5、1、0.1、0.01 μg/mL的嘔吐毒素標準溶液進行MALDI-TOF MS 檢測,試驗結(jié)果如圖2所示,每個濃度均可以檢測到嘔吐毒素相應(yīng)m/z值為1 175 的[M+Na]+和1 191 的[M+K]+加合物特征峰,峰高響應(yīng)值均大于104,檢驗結(jié)果與Doellinger等[12]在MALDI-TOF MS反射模式下測得的嘔吐毒素鈉和鉀加合物信號峰位置和響應(yīng)值結(jié)果一致,均檢測到響應(yīng)值大于104的m/z值為1 175 [M+Na]+和m/z值為1 191 [M+K]+。Ulrich 等[11]在線性正模式下測得嘔吐毒素的兩個特征峰為m/z1 171 和1 187,最高響應(yīng)值均大于104,但因儀器和檢測模式條件不同,故特征峰出峰位置存在一定差異。

    本次檢驗結(jié)果中,在最低質(zhì)量濃度0.01 μg/mL 的稀釋液1 μL 中仍可以檢測到相應(yīng)的加合物特征峰,響應(yīng)值大于104,說明該方法具有較高的檢測靈敏度,達到0.01 μg/mL。Ulrich 等[11]使用MALDI-TOF/TOF MS(Bruker Daltonics Gmbh)在線性正模式(m/z800~1 800)下,對不同濃度的嘔吐毒素標準溶液測量的檢出限為1.0 μg/mL;Doellinger 等[12]使用MALDITOF/TOF MS 在正離子反射模式(m/z700~3 500)下,對不同濃度的嘔吐毒素標準溶液測量精密度的為0.25 ng,均低于本次試驗結(jié)果的靈敏度0.01 μg/mL。將各個質(zhì)量濃度的嘔吐毒素特征峰響應(yīng)值與質(zhì)量濃度做折線圖,如圖2所示,從趨勢線上看,兩個嘔吐毒素特征峰m/z值為1 175 [M+Na]+和m/z值為1 191[M+K]+的響應(yīng)值與標準溶液濃度梯度不成線性關(guān)系,這也反映了MALDI-TOF MS 在定量檢測方面存在一定的局限性。

    圖2 嘔吐毒素標準品的濃度曲線(n=2)Fig.2 Concentration curve of cereulide standard (n=2)

    2.2 不同培養(yǎng)條件的檢測結(jié)果

    通過表2的試驗方案進行16 次試驗,檢測分析結(jié)果如表3所示。其中,K為第j列因素m 水平所對應(yīng)的試驗指標和,k為K的平均值。由k的大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。故在m/z1 175 因素A(培養(yǎng)時間)的優(yōu)水平:k4>k1>k3>k2,因素B(培養(yǎng)溫度)的優(yōu)水平:k1>k2,因素C(培養(yǎng)基)的優(yōu)水平:k1>k2>k3,優(yōu)組合為A4B1C1,即MYP 培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)48 h 的培養(yǎng)物;在m/z1 191 因素A(培養(yǎng)時間)的優(yōu)水平:k1>k4>k2>k3,因素B(培養(yǎng)溫度)的優(yōu)水平:k1>k2,因素C(培養(yǎng)基)的優(yōu)水平:k1>k2>k3,優(yōu)組合為A1B1C1,即MYP 培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)12 h 的培養(yǎng)物。

    R為第j列因素的極差,反映了第j列因素水平波動時,試驗指標的變動幅度。R越大,說明該因素對試驗指標的影響越大。因此,根據(jù)表3中極差R的大小,判斷本次試驗各因素的影響主次順序分別是m/z1 175:因素A(培養(yǎng)時間)>因素C(培養(yǎng)基)>因素B(培養(yǎng)溫度);m/z1 191:因素C(培養(yǎng)基)>因素B(培養(yǎng)溫度)>因素A(培養(yǎng)時間)。

    表3 試驗結(jié)果及極差分析Table 3 Test results and range analysis

    以上對m/z1 175 響應(yīng)值和m/z1 191 響應(yīng)值兩項指標單獨分析出的優(yōu)化條件中,除了因素A(培養(yǎng)時間)不一致,因素B(培養(yǎng)溫度)、C(培養(yǎng)基)均一致,綜合快速鑒別的時效性考慮,為了在食品監(jiān)督控制過程中盡快找出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌,故因素A 取A1(12 h),選定最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為A1B1C1,即接種MYP 培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng)12 h 后進行檢驗。

    Ulrich 等[11]用5wt%羊血哥倫比亞瓊脂上37 ℃培養(yǎng)48 h 的培養(yǎng)物,在線性正模式下進行MALDI-TOF MS 檢測,雖然可以檢測到m/z1 171 和1 187 的兩個特征峰,但響應(yīng)值低于104;Doellinger 等[12]用Caso 瓊脂和血平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 的培養(yǎng)物,在反射模式下進行MALDI-TOF MS 檢測,可直接檢測到嘔吐毒素相應(yīng)m/z值為1 175的[M+Na]+和1 191的[M+K]+加合物特征峰,但響應(yīng)值均小于104,只有經(jīng)過溶劑提取處理后再進行檢測,測量數(shù)據(jù)響應(yīng)值才大幅提高(>105)。Carroll等[13]研究顯示,蠟樣芽胞桿菌合成嘔吐毒素的最適溫度為20~30 ℃。故筆者認為,使用MYP 培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)12 h 的培養(yǎng)物直接進行檢測,與CB 4789.14[7]中樣品分離培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度高度契合,有利于產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的生長產(chǎn)毒,可以更快速高效的對產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌進行區(qū)分。

    2.3 方法特異性檢驗結(jié)果

    將49 株野生蠟樣芽胞桿菌和3 株標準菌株,蠟樣芽胞桿菌(CICC 10352)、蕈狀芽胞桿菌(CICC 21473)、蘇云金芽胞桿菌(ATCC 10792)接種到MYP 瓊脂平板上經(jīng)過30 ℃培養(yǎng)12 h 后,挑取培養(yǎng)物進行MALDI-TOF MS 檢測,試驗結(jié)果如表4、圖3、圖4所示,其中2 株含ces基因的蠟樣芽胞桿菌均檢測到嘔吐毒素相應(yīng)的m/z值為1 175 的[M+Na]+和m/z值為1 191 的[M+K]+加合物特征峰,響應(yīng)值均大于104,其他未攜帶ces基因的菌株均未檢測到相應(yīng)的特征峰;標準菌株蠟樣芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌均不攜帶ces基因,試驗結(jié)果均未檢測到相應(yīng)的m/z值為1 175 的[M+Na]+和m/z值為1 191 的[M+K]+加合物特征峰,特異性達到100%。

    圖3 49 株陽性蠟樣芽胞桿菌的MALDI-TOF MS 檢測結(jié)果Fig.3 MALDI-TOF MS detection results of 49 positive strains of Bacillus cereus

    圖4 標準菌株的檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of standard strains

    表4 菌株的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of strains

    Ulrich 等[11]對產(chǎn)嘔吐毒素和非產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌分離株的區(qū)分研究中,121 株測試菌株中有120株MALDI-TOF MS 測定結(jié)果和PCR 分析的比對結(jié)果一致,只有一株產(chǎn)嘔吐毒素菌株在MALDI-TOF MS中呈假陰性,主要是因為該菌株產(chǎn)毒能力極低,無法被檢測到,作者認為該低產(chǎn)毒菌無法構(gòu)成公共衛(wèi)生危害,故MALDI-TOF MS 對產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測方法具有較強的特異性(>99%)。Doellinger等[12]共測試了8 株蠟樣芽胞桿菌,包括高產(chǎn)毒菌2 株,中產(chǎn)毒菌1 株,低產(chǎn)毒菌3 株,非產(chǎn)毒菌2 株,但未給出8 株菌全部的檢測結(jié)果和譜圖,未進行特異性判斷。因此,筆者認為后續(xù)若有條件仍可增大樣本量對該方法的特異性再進一步驗證。

    3 結(jié)論

    蠟樣芽胞桿菌是食品生產(chǎn)過程中污染食物的一個主要來源,是食物中毒的主要致病因子之一。雖然目前有國標方法可以檢測食品中的細菌污染,但該方法不能區(qū)分產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌。MALDI-TOF MS技術(shù)的易用性和廣泛可用性有助于在常規(guī)鑒定中檢出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌,實驗結(jié)果表明,運用MALDI-TOF MS 技術(shù)檢測嘔吐毒素相應(yīng)m/z值為1 175 的[M+Na]+和1 191 的[M+K]+加合物特征峰,可以有效的區(qū)分產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌,該方法的檢測靈敏度可達到0.01 μg/mL。通過正交試驗極差分析結(jié)果,選用樣品培養(yǎng)條件為接種MYP 培養(yǎng)基在30 ℃培養(yǎng) 12 h,培養(yǎng)后直接挑取典型菌落進行MALDI-TOF MS 檢測,這與國標檢測方法GB 4789.14中對食品中蠟樣芽胞桿菌檢驗的分離條件剛好契合,且培養(yǎng)時間減少一半以上,僅需12 h,且上機檢測結(jié)果響應(yīng)值高(>104)。該方法對產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌檢測特異性強(100%),靈敏度高(0.01 μg/mL),因此可在食品樣品檢測過程中,使用MYP 培養(yǎng)基平板上的典型菌落直接進行MALDI-TOF MS 檢測,如果檢測到m/z值為1 175 的[M+Na]+和m/z值為1 191的[M+K]+加合物特征峰且響應(yīng)值大于104,即可判斷該菌為疑似產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌,從而鎖定該樣品并進行進一步的傳統(tǒng)細菌鑒定和毒力基因檢測確認。該方法是一種適合產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的高通量篩查技術(shù),操作簡單、靈敏,可為食品生產(chǎn)危害控制及快速監(jiān)管提供技術(shù)支持,可實現(xiàn)對消費者的保護和食品加工質(zhì)量的保障,應(yīng)用前景廣闊。

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