基于電子鼻、HS-GC-IMS、HS-SPME-GC-MS技術(shù)聯(lián)用分析不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性成分差異

陽(yáng)丹，陳小愛，楊玉潔，蔡舒，陳樹喜，周愛梅,,3*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）（2.廣東展翠食品股份有限公司，廣東潮州 515634）（3.華農(nóng)（潮州）食品研究院有限公司，廣東潮州 521021）

老香黃（也稱佛手香黃、老香櫞）是以新鮮佛手柑為原料經(jīng)過(guò)鹽制、干燥、蒸熟、浸糖液、浸中藥粉液等步驟，最后再封壇發(fā)酵制成的，具有止咳化痰、去積祛風(fēng)、理氣開胃等功效，作為嶺南特有的保健制品，它久藏不壞，且愈久藥效愈佳[1,2]。但目前，老香黃并無(wú)統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的制作工藝以及行業(yè)規(guī)范，主要依靠家庭或小作坊等生產(chǎn)形式進(jìn)行生產(chǎn)，導(dǎo)致各家老香黃品質(zhì)有差異[3]。老香黃發(fā)酵年份不同，其品質(zhì)和功能上都具有很大差別[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于不同發(fā)酵年份老香黃的研究較少，且主要集中在腌制過(guò)程、不同廠家老香黃的成分變化以及食用安全性研究。嚴(yán)贊開等[5]運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，腌制期間老香黃的(Z)-2,3-丁二醇、(E)-2,3-丁二醇的含量明顯增加；林良靜等[6]運(yùn)用氣相離子遷移譜（Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry，GC-IMS）技術(shù)通過(guò)相對(duì)香氣活度值（ROAV）計(jì)算分析得出，不同廠家老香黃的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性物質(zhì)是甲硫基丙醛；有研究者[7-9]從微生物、添加劑含量檢測(cè)方面驗(yàn)證了老香黃的食用安全性。而對(duì)于不同發(fā)酵年份老香黃的成分變化的研究，目前主要集中在非揮發(fā)性成分方面。如郭舒臣等[3]對(duì)不同年份老香黃非揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)分析得出，貢獻(xiàn)最大的差異化學(xué)標(biāo)志物是5,7-二甲氧基香豆素。老香黃發(fā)酵年份越長(zhǎng)，功能越好，價(jià)格越貴，且在發(fā)酵期間表現(xiàn)出獨(dú)特的風(fēng)味，但是對(duì)于不同發(fā)酵年份老香黃風(fēng)味的研究鮮見報(bào)道，尤其是對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味成分研究更少。食品香氣成分與食品的揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)，作為食品風(fēng)味的重要組成部分，對(duì)食品的整體評(píng)估有重要意義[10]。此外，揮發(fā)性化合物具有芳香、抗真菌、殺蟲、生物信號(hào)和治療特性。因此，檢測(cè)揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)于評(píng)估食品質(zhì)量、真實(shí)性、純度和來(lái)源非常重要[11,12]。

本課題組前期對(duì)發(fā)酵不同月份老香黃的揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6～12 個(gè)月老香黃揮發(fā)性成分差異較大[13]，本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性成分的變化。研究采用電子鼻、頂空-氣相色譜-離子遷移譜（Headspace-Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry，HS-GC-IMS）和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Headspace Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS）三項(xiàng)技術(shù)聯(lián)用，發(fā)揮它們?cè)诒憬菪浴⒏咝砸约办`敏性等方面的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)[14]，更加全面分析不同發(fā)酵年份揮發(fā)性成分變化。同時(shí)利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least Squares Regression Discriminant Analysis，OPLS-DA）法篩選出發(fā)酵不同年份期間老香黃差異性化學(xué)標(biāo)志物，為判別不同年份老香黃提供依據(jù)，為建立一套不同年份老香黃質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老香黃由廣州展翠食品股份有限公司提供，為相同工藝下常溫密封發(fā)酵0、1、2、3、4、5年的樣品，將其分別命名為0Y、1Y、2Y、3Y、4Y、5Y。

PEN3 型便攜式電子鼻系統(tǒng)，德國(guó)Airsense 公司；Flavour Spec 1H1-00053 型氣相離子遷移譜聯(lián)用儀，德國(guó)G.A.S 公司；HP6890-5973 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Aglient 公司；固相微萃取SPME 進(jìn)樣手柄，美國(guó)SUPELCO 公司；75 μm CAR/PDMS 固相微萃取纖維，美國(guó)SUPELCO 公司；四氟乙烯橡膠蓋頂空瓶，廣州市叢源儀器有限公司；AL104 萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電子鼻分析

（1）樣品處理

精確稱量3.0 g 老香黃，充分研磨后，立即裝入50 mL 密封進(jìn)樣瓶中，室溫平衡30 min 后檢測(cè)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

（2）檢測(cè)條件

電子鼻運(yùn)行參數(shù)：分析采樣時(shí)間120 s，采樣時(shí)間間隔1 s，清洗時(shí)間為120 s，歸零時(shí)間10 s，準(zhǔn)備進(jìn)樣時(shí)間5 s，傳感器和樣品流速均為400 mL/min，載氣為空氣，清洗傳感器后進(jìn)樣[13]。本研究選取數(shù)據(jù)較平穩(wěn)的111 s 為信采集時(shí)間。PEN3 型電子鼻由10 個(gè)金屬氧化物傳感器（MOS）組成，傳感器所代表的物質(zhì)種類及性能描述如表1所示。

表1 PEN3 傳感器性能描述Table 1 PEN3 sensor performance description

1.2.2 HS-GC-IMS 分析

頂空進(jìn)樣條件：稱取2 g 細(xì)磨樣品放入20 mL 玻璃瓶中；孵化溫度：60 ℃；孵化時(shí)間：15 min；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min；進(jìn)樣針溫度：65 ℃；進(jìn)樣體積：500 μL。

GC 條件：色譜柱（FS-SE-54-CB-1，15 m×0.53 mm，1 μm）；色譜柱溫：60 ℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min；載氣為高純度N2（純度≥99.999%）；載氣流量：2.00 mL/min，保持2 min，在2～20 min 線性增至100.00 mL/min，然后保持10 min。

IMS 條件：離子源為氚源（6.5 keV），正離子模式，漂移管長(zhǎng)度9.8 cm，管內(nèi)線性電壓500 V/cm，漂移氣流量：150 mL/min；漂移氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%）；IMS 溫度：45 ℃。外標(biāo)為n-酮C4-C9，計(jì)算各化合物的保留指數(shù)（RI）。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS 分析條件

頂空固相微萃?。℉S-SPME）條件：老香黃研碎后密封，取6.0 g 樣品到30 mL 萃取瓶中，使用微量注射器向萃取瓶?jī)?nèi)加入1 μL 2-辛醇（500 μg/mL）標(biāo)品溶液，然后在70 ℃的恒溫磁力攪拌器上平衡15 min，用活化的固相微萃取針萃取30 min，然后插入GC 進(jìn)樣口，解析3 min。

GC 條件：DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：70 ℃保持2 min，以3℃/min 升到120 ℃，最后以4 ℃/min 升高至230 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；不分流進(jìn)樣；載氣（He）流速1 mL/min。

MS 條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍為m/z35～600 u。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS內(nèi)置NIST08.L化學(xué)工作站標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)鑒定揮發(fā)性成分，輔以內(nèi)標(biāo)法確定各種成分的含量。使用GC-IMS 設(shè)備自帶的儀器分析軟件，包括LAV 和插件（Gallery Plot、Reporter）對(duì)樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行采集和分析，通過(guò)保留指數(shù)（RI）和漂移時(shí)間與GC-IMS 文庫(kù)以及峰面積歸一化處理進(jìn)行化合物定性定量分析。使用正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）篩選化學(xué)差異物；SPSS 23.0 軟件做主成分分析（PCA），采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的差異顯著性分析，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于電子鼻分析不同發(fā)酵年份老香黃的揮發(fā)性成分

電子鼻是一種氣味檢測(cè)技術(shù)，它模仿人類的嗅覺系統(tǒng)，為食品的新鮮度評(píng)價(jià)、過(guò)程監(jiān)測(cè)和質(zhì)量控制提供低成本、快速的感官信息[15]。PCA 是一種生成主成分（PC）變量的方法，以消除原始特征變量之間的相關(guān)性[16]。由PCA（圖1）得知，總貢獻(xiàn)率為82.35%（PC1 63.45%和PC2 18.90%），說(shuō)明這兩個(gè)主成分可以解釋不同樣本的主要特征信息。從對(duì)主成分1 的貢獻(xiàn)度來(lái)看，PC1 值按5Y＜3Y＜2Y＜4Y＜1Y＜0Y 的順序增加，而PC2值則按0Y＜2Y＜1Y＜3Y＜4Y＜5Y 的順序遞增。Wang等[17]將黃酒陳釀年份與其風(fēng)味物質(zhì)的變化結(jié)合，用以區(qū)分黃酒年齡，不同發(fā)酵年份老香黃的PCA 空間分布區(qū)域顯示，除了3年和4年樣品的置信區(qū)間有所重合之外，其余年份的樣品分布較為獨(dú)立，可以大致區(qū)分不同發(fā)酵年份老香黃。其中，發(fā)酵3年和4年的老香黃風(fēng)味成分最為相似，其余發(fā)酵年份風(fēng)味存在較大差異，未發(fā)酵的老香黃與其他樣品相比，分布距離最遠(yuǎn)，差異較大，說(shuō)明發(fā)酵工藝對(duì)風(fēng)味的影響較大[18-20]。

圖1 電子鼻不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性成分的PCA 圖Fig.1 PCA diagram of volatile components of Lao Xianghuang in different fermentation years of electron nose

2.2 基于HS-GC-IMS 分析不同發(fā)酵年份老香黃的揮發(fā)性風(fēng)味成分變化

頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）是一種相對(duì)較新的技術(shù)，利用不同離子漂移時(shí)間的差異進(jìn)行物質(zhì)分析，對(duì)于一些揮發(fā)性有機(jī)化合物的痕量檢測(cè)非常適用[21]。采用GC-IMS 對(duì)其進(jìn)行風(fēng)味捕捉，儀器自帶的軟件生成離子遷移指紋圖譜（圖2）。橫軸為檢測(cè)出揮發(fā)性成分，縱軸為發(fā)酵0、1、2、3、4、5年的老香黃，圖中顏色的深淺代表濃度高低，由于單體離子和中性分子可能在漂移區(qū)形成附屬物，因此一種化合物可能會(huì)產(chǎn)生多個(gè)信號(hào)或點(diǎn)（單體和二聚體，在文中分別以M 和D 表示）。結(jié)合圖2和表2來(lái)看，GC-IMS共檢測(cè)出39 種揮發(fā)性成分，包括萜烯類8 種、醇類5種、醛類9 種、酯類4 種、酮類4 種、酚類1 種、酸類2 種、雜環(huán)化合物5 種以及其它1 種。

從指紋圖譜（圖2）可以看出，0Y 樣品中反式-β-羅勒烯、戊酸乙酯、糠醛、乙酸丁酯、丙酮、2-呋喃甲醇等物質(zhì)的含量較高；1Y 樣品中α-松油烯、壬醛、戊醛、丙酸、4-甲基愈創(chuàng)木酚、乙酸乙酯等物質(zhì)的含量較高；2Y 樣品中3-蒈烯、月桂烯、β-蒎烯、α-蒎烯、芳樟醇、庚醛、2-乙?；秽?-甲基丁酸、反式-橙花叔醇、2-丁酮、2-乙基呋喃等物質(zhì)的含量較高；3Y 樣品中異松油烯、莰烯、異戊醛、二乙酰等物質(zhì)的含量較高；4Y 樣品中檸檬烯、己醛等物質(zhì)的含量較高；5Y樣品中香茅醛、桉葉油醇、丁醛、2-乙?；邕虻任镔|(zhì)的含量較高。結(jié)合圖2和表2看，α-蒎烯、反式-β-羅勒烯、芳樟醇、香茅醛、糠醛的含量在發(fā)酵期間較為穩(wěn)定。異戊酸在未發(fā)酵樣品中的含量為0.32%，顯著高于其余階段，其在發(fā)酵5年后含量達(dá)到最低值，為0.02%。2-乙基呋喃、2-丁酮、反式-橙花叔醇、2-乙?；秽任镔|(zhì)在發(fā)酵3年時(shí)含量明顯增加，達(dá)到整個(gè)發(fā)酵階段的最大值，分別為1.33%、10.33%、22.17%、1.82%，在3年以后含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性組分GC-IMS 指紋圖譜Fig.2 GC-IMS fingerprint of volatile components in Lao Xianghuang in different fermentation years

表2 GC-IMS 檢測(cè)不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性成分含量Table 2 GC-IMS detects the volatile component content of Lao Xianghuang in different fermentation years

續(xù)表2

在老香黃發(fā)酵期間，萜烯類物質(zhì)逐漸減少。醇類物質(zhì)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。醛類物質(zhì)呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。酯類、酮類和雜環(huán)化合物呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)?？傮w而言，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，老香黃中的一部分揮發(fā)性物質(zhì)不斷減少，而又有一部分物質(zhì)不斷增多，甚至從無(wú)到有，說(shuō)明揮發(fā)性物質(zhì)成分種類越來(lái)越豐富，這可能與老香黃發(fā)酵過(guò)程中氨基酸和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的相互作用以及有機(jī)酸與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)[22,23]有關(guān)，且從種類和含量來(lái)看，發(fā)酵3年的老香黃揮發(fā)性成分種類較為豐富且含量偏高。

2.3 基于HS-SPME-GC-MS 分析不同發(fā)酵年份老香黃的揮發(fā)性成分

頂空固相微萃取- 氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）是一種常用于檢測(cè)食品風(fēng)味的萃取分離檢測(cè)技術(shù)，它綜合了氣相色譜和頂空固相微萃取的安全性、準(zhǔn)確性和高分離能力，以及質(zhì)譜在物質(zhì)鑒定方面的優(yōu)越性[24]。采用HS-SPME-GC-MS 對(duì)發(fā)酵0年、1年、2年、3年、4年、5年的老香黃揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果如表3、圖3所示。在不同發(fā)酵年份的老香黃樣品中，一共鑒定出50 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括萜烯類、醇類、醛類、酚類、酯類、醚類、雜環(huán)化合物和其它種類與HS-GC-IMS 檢測(cè)出來(lái)的大類物質(zhì)大致相同。其中，不同發(fā)酵年份樣品中發(fā)現(xiàn)共有化合物14 種，分別為α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、萜品油烯、檸檬烯、異松油烯、1-石竹烯、巴倫西亞橘烯、芳樟醇、α-松油醇、糠醛、麥芽酚、茴香腦、2,4-二甲基苯乙烯，與陳小愛等[13]不同月份老香黃結(jié)果相似。

圖3 不同年份老香黃揮發(fā)性成分種類含量圖Fig.3 Type content diagram of Lao Xianghuang volatile components in different years

表3 HS-SPME-GC-MS 分析發(fā)酵不同年份的揮發(fā)性成分含量變化Table 3 HS-SPME-GC-MS analyzed changes in volatile component content in different years of fermentation

續(xù)表3

2.3.1 不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性香氣組分分析

由圖3、表3可知，老香黃揮發(fā)性成分含量最為豐富的是萜烯類物質(zhì)，6 個(gè)發(fā)酵年份總體含量先逐年下降，到第三年略有上升，然后又持續(xù)下降。萜烯類物質(zhì)具有柑橘香、藥草香、檸檬香、胡椒香、辛香、木香等香氣[25,26]。醇類化合物主要由氨基酸脫羧、脫氨產(chǎn)生，在老香黃不同發(fā)酵年份中含量逐漸下降，其具有柑橘、木蘭香氣、蘋果香等香氣，其中(-)-4-萜品醇是發(fā)酵期間產(chǎn)生的不良?xì)馕?，但含量較低[27,28]。醛類物質(zhì)在不同發(fā)酵年份中相對(duì)含量分別為49.33、63.44、69.97、145、137.68、170.88 mg/kg，大體上呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，其具有焦糖味、清新味、桂皮、肉桂油味、肉桂芳香等香味[29-31]。酚類物質(zhì)在不同發(fā)酵年份中相對(duì)含量分別為52.52、42.48、56.32、64.01、39.49、72.11 mg/kg，其中具有焦甜香的麥芽酚為主要物質(zhì)，除此之外酚類物質(zhì)還有丁香、辛香、麝香味[32,33]。酯類物質(zhì)和醚類物質(zhì)在不同年份老香黃中含量均不高，但總體含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中3-呋喃甲酸甲酯具有焦糖香，茴香腦具有甘草、茴香等令人愉悅的氣味[34,35]。雜環(huán)化合物主要有2,5-二甲酰基呋喃的甜香、堅(jiān)果香，以及2-(羥基乙酰基)呋喃的巧克力香、可可，但含量都不高。還有少量具有薄荷糖香的桉葉油醇。

綜上，可以得出萜烯類、醇類、醛類和酚類是老香黃中含量較豐富的物質(zhì)，發(fā)酵不同年份老香黃中萜烯類、醇類、醛類含量變化最為顯著（p＜0.05），萜烯類以及醇類含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，醛類化合物含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與梅明鑫[36]研究沃爾卡姆檸檬果酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的變化趨勢(shì)相似。醇類物質(zhì)的減少與醛類、酯類物質(zhì)的增加可能與發(fā)酵過(guò)程中的氧化、醇類和醛類轉(zhuǎn)化以及微生物合成有機(jī)酸發(fā)生酯化等反應(yīng)有關(guān)[37-39]。

2.3.2 不同發(fā)酵年份老香黃共有揮發(fā)性成分變化分析

選取6 個(gè)發(fā)酵階段都存在的共有化合物，對(duì)其不同階段含量變化進(jìn)行分析。結(jié)合圖4和表3分析，α-蒎烯和β-蒎烯的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的推移呈現(xiàn)降-升-降趨勢(shì)，在發(fā)酵5年后α-蒎烯相對(duì)含量達(dá)到最低值14.04 mg/kg，β-蒎烯發(fā)酵3年后相對(duì)含量達(dá)到最低值14.74 mg/kg，而α-松油醇在發(fā)酵期間呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，在發(fā)酵5年后達(dá)到最大值，相對(duì)含量為45.51 mg/kg。α-松油醇是一種由α-蒎烯和β-蒎烯轉(zhuǎn)化而來(lái)的氧化產(chǎn)物[40]，所以α-蒎烯和β-蒎烯含量降低與α-松油醇含量上升存在一定聯(lián)系，并且有研究發(fā)α-蒎烯在微生物作用下可轉(zhuǎn)化為(-)-4-萜品醇[41]，因此發(fā)酵3年、4年突然出現(xiàn)的(-)-4-萜品醇可能是由α-蒎烯的微生物轉(zhuǎn)化而來(lái)。月桂烯呈穩(wěn)定下降趨勢(shì)，在發(fā)酵5年后相對(duì)含量顯著降低達(dá)到最低值86.54 mg/kg（p＜0.05）。萜品油烯呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵3年后相對(duì)含量達(dá)到峰值90.6 mg/kg。檸檬烯在未發(fā)酵樣品中含量最大，相對(duì)含量為204.89 mg/kg，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移呈現(xiàn)穩(wěn)定下降趨勢(shì)，在發(fā)酵5年后相對(duì)含量顯著降低（p＜0.05），達(dá)到最低值116.63 mg/kg。已有研究發(fā)現(xiàn)，檸檬烯在微生物作用下，其6 位烯丙基可羥基化、氧化得到香芹酚，8 位可氧化得到α-松油醇。由此可以說(shuō)明，老香黃在發(fā)酵階段，大量檸檬烯被微生物催化轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致含量逐年下降[42-44]。異松油烯、芳樟醇和1-石竹烯在發(fā)酵期間均呈現(xiàn)穩(wěn)定下降趨勢(shì)。巴倫西亞橘烯呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，在發(fā)酵5年時(shí)達(dá)到峰值，相對(duì)含量為69.15 mg/kg。糠醛為多糖的次級(jí)代謝產(chǎn)物[45]，在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)。茴香腦相對(duì)含量在發(fā)酵期間均呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)，在發(fā)酵5年后顯著上升（p＜0.05），達(dá)到最大值30.96 mg/kg。麥芽酚相對(duì)含量在發(fā)酵期間呈現(xiàn)升-降-升趨勢(shì)，在發(fā)酵3年后達(dá)到峰值56.53 mg/kg。2,4-二甲基苯乙烯相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定下降趨勢(shì)，在發(fā)酵5年后達(dá)到最低值，為10.46 mg/kg。

圖4 不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性共有成分變化趨勢(shì)圖Fig.4 Trend of volatile components of Lao Xianghuang in different fermentation years

總體而言，在老香黃中月桂烯與檸檬烯相對(duì)含量最高，但是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而降低；糠醛和茴香腦在發(fā)酵期間相對(duì)含量逐漸上升；芳樟醇、異松油烯和1-石竹烯在發(fā)酵期間總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；α-蒎烯和β-蒎烯在發(fā)酵期間呈現(xiàn)降-升-降的趨勢(shì)；α-松油醇和巴倫西亞橘烯發(fā)酵前期相對(duì)含量逐漸降低，但是在發(fā)酵2年后相對(duì)含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；萜品油烯和2,4-二甲基苯乙烯在發(fā)酵0-2年相對(duì)含量升高，但是2年后相對(duì)含量發(fā)生下降；麥芽酚發(fā)酵期間呈現(xiàn)升-降-升趨勢(shì)。

2.3.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）不同年份共有揮發(fā)性成分

OPLS-DA 是在偏最小二乘判別（Partial Least Squares Regression Discriminant Analysis，PLS-DA）的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展起來(lái)的，通過(guò)正交化，排除與分類無(wú)關(guān)的自變量，減少誤差，從而達(dá)到篩選不同樣本的特征變量的目的[46]。一般認(rèn)為，變量投影重要性（VIP）大于1 時(shí)，則表明該變量對(duì)于模型中各個(gè)類別的區(qū)分有重要意義。

將不同發(fā)酵年份14 個(gè)共有揮發(fā)性成分進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，經(jīng)OPLS-DA 分析R2 為0.593，Q2 為0.679，R2 和Q2 均大于0.500，說(shuō)明此模型構(gòu)建成功，具有很好的擬合度和預(yù)測(cè)能力。對(duì)化學(xué)標(biāo)志物含量的VIP 值大小進(jìn)行排序。Var1～Var14 分別代表α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、萜品油烯、檸檬烯、異松油烯、1-石竹烯、巴倫西亞橘烯、芳樟醇、α-松油醇、糠醛、麥芽酚、茴香腦、2,4-二甲基苯乙烯。由圖5可知，老香黃VIP 值大于1 的差異化學(xué)標(biāo)志物有8 種，其中有6種萜烯類差異物質(zhì)分別為，Var5（檸檬烯）、Var3（月桂烯）、Var6（異松油烯）、Var13（1-石竹烯）、Var1（α-蒎烯）以及Var8（巴倫西亞橘烯），萜烯類物質(zhì)是蕓香科植物中含量較高的物質(zhì)，具有香甜花草香，有研究報(bào)道佛手在腌制放置過(guò)程中萜烯類物質(zhì)持續(xù)下降[5]；另外兩種分別為Var11（糠醛）、Var9（芳樟醇），糠醛是在發(fā)酵過(guò)程中含量持續(xù)上升的焦甜香物質(zhì)，主要是多糖降解產(chǎn)生的[45]，芳樟醇隨著發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)含量逐漸降低，一般在生佛手中含量較高[47]。以上8 種化學(xué)成分對(duì)6 個(gè)發(fā)酵階段的老香黃的分類有顯著影響，這些成分是引起不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性物質(zhì)變化的主要差異性化學(xué)標(biāo)志物，可為區(qū)分不同發(fā)酵年份老香黃提供一定依據(jù)。

圖5 OPLS-DA 分析不同發(fā)酵年份老香黃共有成分差異貢獻(xiàn)度圖Fig.5 OPLS-DA Analysis of the difference contribution of common components in different fermentation years Lao Xianghuang

3 結(jié)論

本文主要利用電子鼻、HS-GC-IMS、HS-SPMEGC-MS 三種不同的技術(shù)聯(lián)用對(duì)不同發(fā)酵年份老香黃揮發(fā)性成分變化進(jìn)行分析，并結(jié)合OPLS-DA 分析不同發(fā)酵年份老香黃特征性成分。電子鼻分析結(jié)果得知，PCA 能明顯區(qū)分發(fā)酵與未發(fā)酵老香黃，未發(fā)酵的老香黃風(fēng)味與發(fā)酵的差異較大，其中發(fā)酵3、4年老香黃風(fēng)味成分相似，而發(fā)酵1年、2年、5年老香黃風(fēng)味差異較大，說(shuō)明發(fā)酵工藝對(duì)老香黃風(fēng)味的影響較大。HS-GC-IMS 和HS-SPME-GC-MS 所測(cè)出的基礎(chǔ)風(fēng)味物質(zhì)種類基本一致，且鑒定出物質(zhì)變化趨勢(shì)也大致相同，萜烯類以及醇類含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，醛類化合物含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是，酸類物質(zhì)是HS-GC-IMS 技術(shù)優(yōu)于HS-SPME-GC-MS 技術(shù)檢測(cè)到的小分子（C2～C10）、低含量的物質(zhì)。HS-GC-IMS 定性檢測(cè)出39 中揮發(fā)性成分，包括萜烯類8 種、醇類5種、醛類9 種、酯類4 種、酮類4 種、酚類1 種、酸類2 種、雜環(huán)化合物5 種以及其他1 種。離子遷移指紋圖可以直觀的看出老香黃在不同發(fā)酵年份期間各種揮發(fā)性成分的變化情況，且伴有部分物質(zhì)的消失和新物質(zhì)的形成。HS-SPME-GC-MS 的結(jié)果中一共鑒別出50 種揮發(fā)性成分，包括萜烯類16 種、醇類10 種、醛類6 種、酚類4 種、酯類3 種、醚類1 種、雜環(huán)化合物3 種和其它類7 種。不同發(fā)酵年份樣品中發(fā)現(xiàn)共有化合物14 種，然后結(jié)合OPLS-DA 分析揮發(fā)性化合物的變化，共篩選出8 種差異性化學(xué)標(biāo)志物，分別為檸檬烯、月桂烯、異松油烯、1-石竹烯、糠醛、芳樟醇、α-蒎烯、巴倫西亞橘烯，可為鑒別不同年份老香黃提供一定理論依據(jù)。