多功能針式過濾器凈化-UPLC-MS/MS法同步測定香蕉全果、果肉及葉中9種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留

覃國新，李慧玲，周其峰，楊玉霞，何潔，韋宇寧，王海軍，陳泳锨，王天順，陳偉，黃曲燕

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心(南寧)，廣西南寧 530007）（2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，廣西南寧 530007）

香蕉是全球重要的熱帶水果之一，也是消費量和貿(mào)易量名列前茅的水果品種之一[1,2]。我國是香蕉第二大生產(chǎn)國，香蕉消費量在總水果消費量中排名第4[1,2]。香蕉已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)國非常重要的糧食和經(jīng)濟作物，在提高農(nóng)村經(jīng)濟收入中起關鍵性的作用。因此，香蕉鮮果的產(chǎn)品質(zhì)量安全一直備受關注，然而長期以來人們的關注點在于香蕉中的農(nóng)藥殘留，忽視了香蕉及香蕉葉中的植物生長調(diào)節(jié)劑（Plant Growth Regulators，PGRs）殘留。PGRs 是一類廣泛用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)種植的植物激素化合物，它們可以促進或者抑制植物的生長，可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程[3,4]。但若其在香蕉及香蕉葉中殘留量過高，不僅可致畸致癌、影響心機功能等毒副作用，而且會對生態(tài)環(huán)境會造成不可估量的毒害[5]。然而，目前我國國家標準未規(guī)定有香蕉中PGRs的殘留限量值以及檢測標準。所以，建立快速檢測香蕉產(chǎn)品中PGRs 殘留的分析方法具有重要意義。

目前，對果蔬農(nóng)產(chǎn)品中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-8]、液相色譜法[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]。前處理技術(shù)主要有固相萃取法[11,12]、簡單、快速、安全、價格低廉的分散固相萃取凈化法（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe，QuEChERS）[13,14]等。近年來，基于QuEChERS原理，報道了通過式固相萃取前處理凈化技術(shù)[15,16]，覃國新等[17]基于通過式固相萃取凈化技術(shù)，建立了同步測定蔬菜中克百威和涕滅威及代謝物殘留的檢測方法，該凈化方法明顯縮短了樣品前處理時間，具有方便、快捷等優(yōu)點。多功能針式過濾器凈化是在通過式固相萃取技術(shù)的基礎上，將樣品提取溶液的凈化和過濾集于一步完成而建立的農(nóng)藥多殘留檢測樣品前處理技術(shù)[18]，相對于QuEChERS 法，多功能針式過濾器凈化方法節(jié)省了振搖凈化及離心的多個環(huán)節(jié)，極大地提高了檢測效率。

常見的用于果蔬種植中的植物生長調(diào)節(jié)劑主要有矮壯素、縮節(jié)胺、多效唑、丙環(huán)唑、抗倒酯、氯苯胺靈、氯吡脲、烯效唑、抑芽丹、蕓苔素內(nèi)酯、吲哚乙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、胺鮮酯、赤霉素等。但我國國家標準GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中僅規(guī)定了2,4-D、矮壯素、胺鮮脂、單氰胺、丁酰肼、多效唑、氟節(jié)胺、復硝酸鈉、甲哌鎓（助壯素）、抗倒酯、氯苯胺靈、氯吡脲、萘乙酸、噻苯隆、噻節(jié)因、四氯硝基苯、調(diào)環(huán)酸鈣、烯效唑、乙烯利和抑芽丹等20 種PGRs 在部分果蔬中的殘留限量標準及檢測標準，目前尚未見采用多功能針式過濾器凈化方法對香蕉全果、香蕉果肉及香蕉葉中烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲等9 植物生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測前處理的研究報道。因此，本實驗建立了多功能針式過濾器凈化-超高效液相色串聯(lián)質(zhì)譜同步檢測香蕉全果、香蕉果肉和香蕉葉中烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲9 種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

Xevo TQ-S 型超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜用儀（UPLC-MS/MS）配有電噴霧離子源，美國Waters 公司；DS-1 型高速組織搗碎機，上海標模儀器廠；LD5-2A 型離心機，北京京立離心機有限責任公司；多功能針式過濾器（含150 mg MgSO4、50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、50 mg 十八烷基鍵合相硅膠（C18）），天津阿爾塔科技有限公司；

烯效唑（純度≥98.0%，m/m）、多效唑（純度≥98.8%，m/m）、噻苯?。兌取?9.4%，m/m）；胺鮮酯（純度≥99.7%，m/m）、吲哚丁酸（純度≥99.5%，m/m）、吲哚乙酸（純度≥99.6%，m/m）、蕓苔素內(nèi)酯（純度≥98.0%，m/m）、丙環(huán)唑（純度≥99.0%，m/m）、氯吡脲（純度≥99.5%，m/m）、乙酸（色譜純），上海安普實驗科技股份有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾（中國）科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量的9 種待測化合物標準品，用乙腈配制成濃度為1 000 mg/L 的標準儲備液；準確移取9種標準儲備液，用乙腈稀釋成濃度為10.0 mg/L 的標準中間混合溶液；使用時用乙腈或者空白基質(zhì)提取凈化液逐級稀釋至所需要的濃度。

1.3 樣品前處理

提取：取香蕉全果、香蕉果肉和香蕉葉試樣，采用組織搗碎機搗碎制備得到混合均勻的樣品，稱取10.00 g，加入20.0 mL 體積分數(shù)1%乙酸乙腈，渦旋提取1 min，加入3 g 氯化鈉，再渦旋提取1 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液待凈化。

凈化：取上述上清液1.5 mL 以2 滴/s 的速度通過多功能針式過濾器于進樣瓶中，供UPLC-MS/MS 測定。

1.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1×100 mm，1.7 μm），美國Waters 公司；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫程序為：0～0.8 min，90% A；0.8～1.8 min，90%～70% A；1.8～3.8 min，70%～50% A；3.8～5.5 min，50%～30% A；5.5～7.0 min，30%～10% A；7.0～8.5 min，10% A；8.5～ 9.2 min，10%～50% A；9.2～9.6 min，50%～90% A；9.6～10.0 min，90%；柱溫35 ℃，流速0.25 mL/min，進樣體積2.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧ESI+離子源和多反應監(jiān)測（MRM）的模式；脫溶劑氣溫度350 ℃，電噴霧電壓3.0 kV，離子源的溫度為150 ℃，脫溶劑的氣體流速為700 L/hr。在儀器檢測分析過程的中，以母離子和兩個子離子的信息比較來定性分析；用母離子及響應值最高的子離子來定量分析。9 種PGRs 的多反應監(jiān)測模式質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 9 種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS analysis parameters for the 9 PGRs

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的確定

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于9 種PGRs 中絕大多數(shù)化合物屬于含氮的堿性化合物，根據(jù)目標化合物的性質(zhì)，在質(zhì)譜掃描時堿性化合物適合選擇正離子（ESI+）模式掃描。因此，本實驗采用正離子的掃描方式，以濃度大小為0.1 mg/L 的標準溶液掃描測定，優(yōu)化了烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲的母離子分別為m/z292.2、294.1、221、216、204、176、481.2、342、248.1。其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

當用正離子（ESI+）模式進行掃描時，加酸可以向待測化合物提供H+，以提高化合物在質(zhì)譜中的響應值；實驗考察了以甲醇及乙腈做為有機流動相的分離效果，當選用乙腈時9 種PGRs 的峰形更好且響應值更高，綜合考慮，本文采用乙腈和0.1%甲酸作為流動相，并優(yōu)化了流動相的梯度洗脫程序，以獲得更好的分離效果。

在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲在香蕉全果、香蕉果肉和香蕉葉混合空白基質(zhì)加標下的MRM 色譜圖如圖1，出峰時間依次為6.16、5.73、4.22、3.51、4.56、3.75、5.73、6.74、4.95 min，由圖1可見，樣品基質(zhì)不干擾待測化合物的測定。

圖1 9 種PGRs 在香蕉全果、香蕉果肉和香蕉葉混合空白基質(zhì)加標（0.1 mg/kg）下的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 9 PGRs of mixed blank samples of banana whole fruit,banana pulp and banana leaf spiked at 0.1 mg/kg level

2.2 凈化方式的選擇

目標物的提取及凈化是植物源性樣品農(nóng)藥殘留測定的重要環(huán)節(jié)，其直接影響檢測方法的重現(xiàn)性和回收率。本文采用體積分數(shù)1%乙酸乙腈渦旋提取，加入氯化鈉，再渦旋提取，離心后，上清液直接經(jīng)過多功能針式過濾器凈化以吸附色素、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，與QuEChERS 分散固相萃取凈化方式對比，本方法操作更簡便，適合批量快速檢測需求。

2.3 考察樣品的基質(zhì)效應

取不含待測PGRs 的香蕉全果、香蕉果肉和香蕉葉樣品，經(jīng)“1.3”方法處理，得到空白樣品基質(zhì)提取的凈化溶液，用此溶液逐漸稀釋10 mg/L 的混合標準溶液，配成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 和0.5 mg/L 的基質(zhì)標準工作溶液。在以上優(yōu)化的實驗條件下上機檢測，用目標物的質(zhì)量濃度（X，mg/L）作為橫坐標，相對應定量離子對的峰面積（Y）作為縱坐標制作基質(zhì)標準曲線?；|(zhì)校準曲線斜率與純?nèi)軇┬是€斜率的比值即為基質(zhì)效應（ME），當計算得到ME值越接近于1時，基質(zhì)效應就越小，具體實驗結(jié)果見表2。從表2可知，烯效唑在香蕉果皮、香蕉果肉和香蕉葉片中以及蕓苔素內(nèi)酯在香蕉果皮、香蕉果肉中的基質(zhì)效應很大（ME＞1.7），胺鮮酯的基質(zhì)效應較弱（ME值接近于1），其它化合物均存在程度不同的基質(zhì)效應。這可能與化合物本身性質(zhì)、待測樣品基質(zhì)及目標物離子化的效果有關，為減小基質(zhì)效應，采用基質(zhì)校準進行定量。

2.4 方法的線性范圍、檢出限及定量限

在上述優(yōu)化的實驗條件下，香蕉全果、香蕉果肉和香蕉葉中的烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲在0.001～0.5 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關系（9 種PGRs 在香蕉全果中的基質(zhì)標準曲線圖如圖2所示），不同基質(zhì)標準曲線線性方程見表2，相關系數(shù)均大于0.999 2。以3 倍信噪比（S/N=3）計算得到9 種PGRs的檢出限（LOD）分別為0.50、0.20、0.50、0.80、10.00、10.00、3.00、0.20 和4.00 μg/kg，以S/N=10計算得到其定量限（LOQ）分別為1.60、0.70、1.60、2.50、33.50足檢測需要。

圖2 不同質(zhì)量濃度烯效唑(a)；多效唑(b)；噻苯隆(c)；胺鮮酯(d)；吲哚丁酸(e)；吲哚乙酸(f)；蕓苔素內(nèi)酯(g)；丙環(huán)唑(h)和氯吡脲(i)在香蕉全果中的線性關系Fig.2 Linear relationship of uniconazole (a); paclobutrazol (b);thidiazuron (c); diethyl aminoethyl hexanoate (d); indolyl butyric acid (e); indolyl acetic acid (f); brassinolide (g);propiconazole (h) and forchlorfenuron (i) with various concentrations in banana whole fruit

表2 香蕉果皮、香蕉果肉和香蕉葉片中9 種植物生長調(diào)節(jié)劑的基質(zhì)效應Table 2 Matrix effects of 9 PGRs in matrix of banana whole fruit,banana pulp and banana leaf

2.5 回收率和精密度

取未檢出有9 種待測目標化合物的香蕉全果、香蕉果肉及香蕉葉為空白樣品進行加標回收實驗（多功能針式過濾器和QuEChERS 對比），10 g 樣品中9 種PGRs 的加標濃度分別為0.05、0.10、0.50 mg/kg。測定結(jié)果見表3。在香蕉全果、香蕉果肉及香蕉葉中，本方法的平均添加回收率在80.50%～113.00%，QuEChERS 法的平均添加回收率在80.70%～112.30%之間，兩種方法的相對標準偏差（RSD）分別為0.40%～5.60%和1.00%～5.90%。可見，它們的回收率及精密度都達到要求，但多功能針式過濾器前處理凈化法，集凈化和過濾一步完成，省去了振搖分散凈化及離心環(huán)節(jié)，簡化了凈化步驟、縮短了前處理時間，不但有效提高了檢測效率，而且能很好除去提取液中色素、蛋白質(zhì)等基質(zhì)干擾物質(zhì)，本方法更簡便、快捷。

表3 檢測樣品中9 種植物生長調(diào)節(jié)劑的平均加標回收率與相對標準偏差（n=6）Table 3 Average spiked recoveries and RSD (n=6) of 9 PGRs in real samples

2.6 實際樣品的檢測

從種植地中取10 份香蕉及對應的香蕉葉樣品，按“1.3 節(jié)”處理，對其中的烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲進行檢測，均未檢出有上述PGRs 殘留。

3 結(jié)論

本研究建立了多功能過濾器凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同步測定香蕉全果、香蕉果肉及香蕉葉中烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鮮酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、蕓苔素內(nèi)酯、丙環(huán)唑和氯吡脲殘留的分析方法。樣品經(jīng)1%（V/V）乙酸-乙腈提取，多功能針式過濾器一步式凈化后，采用電噴霧ESI+離子源和多反應監(jiān)測（MRM）的模式進行質(zhì)譜測定。方法檢出限（LOD）在0.20～10.00 μg/kg 之間，定量限（LOQ）在0.70～33.50 μg/kg 之間。該方法簡便快捷，具有良好的準確度、靈敏度和精密度，適用于同步批量快速檢測烯效唑等9種PGRs 在香蕉全果、香蕉果肉及香蕉葉片中的殘留。