NF-κB相關信號通路在腎缺血-再灌注損傷中作用的研究進展

張瑞波 申開文 袁強 王強 沈俊

缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是腎移植中復雜且不可避免的病理生理過程，同時也是移植腎出現(xiàn)無功能或功能延遲的最重要原因之一。IRI的機制較為復雜，迄今為止，有關IRI的發(fā)生機制和病理生理過程的研究尚無定論。據報道，腎IRI中的炎癥反應可能與T細胞介導和抗體介導的急性排斥反應有關。此外，腎IRI也可能會導致腎間質纖維化和腎小管萎縮，從而引起慢性移植腎功能障礙[1]。腎IRI常伴隨著促炎因子的釋放，使腎小管結構受損，并導致腎小管細胞的損傷和死亡，是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的常見因素[2]。核因子（nuclear factor，NF）-κB作為許多炎癥反應信號通路的關鍵因子，對腎IRI炎癥反應的調控起著十分重要的作用。本文將從NF-κB相關信號通路入手，對腎IRI的可能機制進行總結，以期為腎IRI的防治提供參考。

1 NF-κB信號通路的作用機制

1.1 NF-κB的結構組成

NF-κB是一個轉錄因子家族，由5個家族成員組 成， 即 p65/RelA、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50/p105）以及 NF-κB2（p52/p100）。5個成員都具有一個結構保守的氨基末端Rel同源結構域（Relhomology domain，RHD）包括二聚體、核定位和DNA結合結構域。p65/RelA、RelB、c-Rel不僅具有表達陽性調控所必需的轉錄激活域（transcription activation domain，TAD），還具有促進基因轉錄的反式激活域，該反式激活域被激活后，NF-κB亞單位形成同源或異源二聚體。而p50和p52由于缺乏TAD，可能抑制轉錄，p50和p52同源二聚體可與NF-κB反應啟動子上的κB位點結合，起到檢查NF-κB反式激活的作用。NF-κB信號通路由受體和受體近端信號接合器分子、IκB激酶（IκB kinase，IKK）復合物、IκB蛋白及NF-κB二聚體組成，可分為依賴NF-κB必需調節(jié)器（NF-κB essential modulator，NEMO）的經典激活途徑和不依賴NEMO的非經典激活途徑[3-4]。

1.2 NF-κB信號通路的激活途徑

1.2.1 依賴NEMO的經典激活途徑NF-κB經典激活途徑形成的二聚體主要是RelA/p50和RelA/p52，可由各種細胞因子、氧化應激以及T細胞受體（T cell receptor，TCR）等誘導刺激。在經典激活途徑中，刺激物包括腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族、白細胞介素（interleukin，IL）-1受體、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）超家族、TCR或細胞內介質的膜結合受體。在刺激物作用下，核糖體失活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）-1作為RIP家族最重要的成員，是NF-κB信號通路中真正的適配器。在TNFR1相關的信號傳導中，RIP-1通過招募IKK綜合體，組成由支架蛋白NEMO（IKKγ）和兩個IKK亞基（包含IKKα和IKKβ兩種激酶）構成的IKK復合物。該信號復合物組裝成核后，通過NEMO的低聚物化和IKK自磷酸化，誘導IKK活化。IKK活化后可激活IκB激酶，使IκB降解和磷酸化，促進NF-κB p65/p50二聚體釋放，使p65亞單位升高，并隱藏NF-κB核定位信號，NF-κB轉錄因子轉錄至細胞核，從而激活NF-κB信號通路[3,5]。

1.2.2 不依賴NEMO的非經典激活途徑非經典激活途徑中，在CD40等因素的刺激下，TNFR相關因子（TNFR-associated factor，TRAF）家族成員中的TRAF3和 TRAF2/6與 NF-κB誘 導 激 酶（NF-κB inducing kinase，NIK）相互作用，誘導NIK的泛素化和降解，并與兩個IKKα亞基組成的復合物發(fā)生反應，使p100降解加工為具有活性的p52，p52與RelB反應組成異源二聚體轉移到細胞核內，激活NF-κB非經典信號通路[3]。

2 NF-κB炎癥相關信號通路在腎IRI中的調控作用

2.1 NF-κB上游信號通路對腎IRI的調控機制

2.1.1 多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1對NF-κB的調控機制多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosinediphosphate-ribose polymerase，PARP）-1是PARP家族中研究較多的典型成員，可參與炎癥反應、免疫反應和DNA修復等過程[6]。在腎IRI中，PARP-1作為調控炎癥反應的轉錄輔助激活劑和輔助加壓因子，其活化過程為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導損傷時，PARP-1保守位點Y829發(fā)生磷酸化，導致PARP-1激活和表達增加，此過程是PARP-1催化活性和NF-κB依賴的促炎調節(jié)必經之路。Y829的磷酸化導致PARP-1的激活和表達增加，其激活可能通過參與調節(jié)NEMO單元泛素化，調節(jié)p65亞基磷酸化（Ser536）和乙?；↙ys310），觸發(fā)IKK對IκBα的活化，促進LPS誘導的NF-κB p65核轉移及表達，激活NF-κB通路，促進炎癥反應的發(fā)生及對腎小管產生破壞性損傷，導致細胞死亡或功能障礙，進而導致腎IRI[7-10]。由此可見，通過對PARP-1的調控，可以影響NF-κB的活性。既往研究表明，使用PARP-1抑制劑JPI-289可以減弱NF-κB的表達，發(fā)揮抗炎作用，減輕炎癥反應，從而減輕腎IRI[10]。其中代表性的藥物瑞芬太尼、苦味苷Ⅱ等可通過下調PARP-1表達水平，抑制NF-κB通路的激活，減輕腎IRI[8,11]。但目前靶向PARP-1減輕腎IRI的藥物研究仍較少，未來可進一步探究PARP-1的靶向藥物，為臨床腎IRI的防治提供新的方向。

2.1.2 Toll樣受體4對NF-κB的調控機制TLR是跨膜蛋白家族，當發(fā)生腎IRI時，作為IRI過程中重要的炎癥級聯(lián)反應，TLR4信號通路被激活和高水平表達。TLR4信號通路的主要激活過程為LPS與LPS結合蛋白的相互作用，促進TLR4與CD14受體結合，導致TLR4二聚體修飾物向細胞膜寡集形成受體復合物，隨后TLR4與銜接蛋白——髓樣分化 因 子 88（myeloid differentiation factor，MyD88）作用，MyD88 N末端的Toll-IL-1受體結構域（Toll-IL-1 receptor domain，TIR） 通 過 TIR/TIR相 互 作用，介導其與TLR結合，而MyD88 C末端的死亡結構域又可與IL-1受體相關激酶（IL-1 receptorassociated kinase，IRAK）-1和IRAK-4的死亡結構域結合，使IRAK-1/4被招募到TLR復合物。緊接著，下游分子TRAF-6被招募到TLR復合物并被IRAK-1或IRAK-4激活。通過轉化生長因子-β活化激酶1結合蛋白（transforming growth factor-βactivated kinase 1 binding protein，TAB）1/2/3的作用，TRAF-6從受體復合物中分離并與轉化生長因子-β活 化 激 酶（transforming growth factor-β-activated kinase，TAK）1結合。在IRAK-1被降解后，TRAF-6-TAB1/2/3-TAK1復合物進入細胞質，誘導TRAF-6介導的TAK1活化，激活IKK，使NF-κB從IκB中被釋放，NF-κB從細胞質轉移到細胞核并介導細胞因子的過度表達，增強炎癥相關蛋白NF-κB的信號級聯(lián)，最終導致腎IRI的發(fā)生[12-14]。

NF-κB是TLR的關鍵下游因子。研究表明，糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）、髓樣分化蛋白（myeloid differential protein，MD）-2、白頭翁皂苷B4等物質可通過上調腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-1β、IL-6 的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達水平，促進炎癥因子釋放，激活TLR4/NF-κB相關通路，導致氧化反應和下游炎癥因子產生的損傷，從而加重腎IRI[12-14]。而白藜蘆醇、紫檀芪、左歸飲、靈芝酸等物質則通過降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3 活性和Caspase級聯(lián)反應，抑制TLR4的表達，并促進IκB表達，減少磷酸化NF-κB和磷酸化IκB的表達，降低氧化應激和細胞凋亡水平，減輕炎癥反應，延緩腎IRI[15-18]。此外，TLR4作為NF-κB的上游信號通路，被證實參與細胞焦亡經典激活途徑的調控，未來可針對腎IRI中細胞焦亡的經典激活途徑進行更深入的研究，為臨床上腎IRI的防治提供新的啟示。

2.1.3 Wnt/β-catenin對NF-κB的調控機制Wnt/β-catenin信號通路是研究最多的經典Wnt通路，β-catenin是細胞間連結的典型Wnt信號通路的重要組成部分。在正常人腎臟中，Wnt通路處于相對沉默狀態(tài)，當發(fā)生腎IRI時，腎巨噬細胞分泌Wnt蛋白，Wnt信號被激活，在經典信號通路中與低密度脂蛋白受體相關蛋白（low-density lipoprotein receptorrelated protein，LRP）5、LRP6以及細胞表面受體卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)rz）結合，磷酸化激活胞內散亂蛋白（dishevelled，Dsh）與Frz胞內區(qū)的結合產物，抑制GSK-3β的活性，使GSK-3β脫離出蛋白復合體，導致蛋白復合體不能降解β-catenin，使得β-catenin不能被磷酸化，從而在胞質內大量蓄積并轉移到細胞核，與轉錄因子中的T細胞因子/淋巴增強因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF） 結 合后，在輔助因子環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白/p300（cyclic adenosine monophosphate response element-blinding protein-binding protein/p300，CBP/p300）的幫助下，通過轉錄上調編碼區(qū)決定子結合蛋白（coding region determinant-binding protein，CRD-BP），保證其介導的含β-轉導重復序列的蛋白質（β-transducing repeat-containing protein，βTrCP）mRNA穩(wěn) 定 化，從而促進βTrCP介導的IκB降解，促進NF-κB的核轉移，激活NF-κB信號通路，加重腎臟炎癥反應，促進下游炎癥因子轉錄，抑制抗氧化因子，從而誘導腎IRI的氧化應激和炎癥反應[19-22]。其次，β-catenin蛋白的蓄積還可通過誘導p38活性，介導NF-κB的激活，但具體調控機制尚不明確。此外，有研究表明β-catenin蛋白可通過上調TNFR超家族成員19（TNFR superfamily member 19，TNFRSF19）mRNA表達水平，活化IKK復合物，激活NF-κB，表明Wnt/β-catenin信號通路在促炎功能上存在著另外一條潛在道路，但該道路的具體機制在腎IRI中尚未明確，未來仍需進行相關研究進一步闡明[22]。有研究表明，聯(lián)用維生素D和吡格列酮可對Wnt/β-catenin通路、NF-κB等進行調節(jié)，有希望對腎臟起保護作用[23]。目前靶向于Wnt/β-catenin對NF-κB進行調控的藥物研究尚少，針對相關靶向藥物進行研發(fā)，可為腎IRI的防治提供新的思路。

2.1.4 磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B對NF-κB的調控機制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路高度保守，其激活受到嚴格的控制。在腎IRI引起的炎癥反應中，PI3K/Akt信號通路激活的機制主要是PI3K通過改變Akt蛋白結構使其活化，使NF-κB磷酸化被抑制，轉錄活性減弱，抑制TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子表達，從而減輕腎IRI導致的炎癥反應[24-25]。Zhang等[24]的實驗發(fā)現(xiàn)，在進行大鼠腎IRI造模前30 min腹腔注射促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO），可以增強EPO受體活性，并通過進一步激活PI3K/Akt信號通路，抑制NF-κB磷酸化，顯著減輕腎功能不全，抑制炎癥反應，但抑制PI3K/Akt信號通路對腎IRI引起的炎癥反應的影響尚未闡明。Hu等[25]的研究報道指出，使用苦豆堿預處理的C57BL/6小鼠，可以通過PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，抑制NF-κB轉錄活性，減輕腎IRI引起的炎癥損傷，保護腎小管細胞免受凋亡。此外，蛇床子素、四甲基哌啶、尼可地爾等也被證實通過激活PI3K/Akt信號，降低NF-κB p65及磷酸化-p65的表達，緩解腎缺血-再灌注引起的AKI[26-28]。由此可見，PI3K/Akt在腎IRI中起關鍵作用，但PI3K/Akt對腎IRI的調控機制不只局限于NF-κB信號通路。對此，未來應盡可能對PI3K/Akt在腎IRI中的調控機制進一步闡明。

2.2 NF-κB下游信號通路對腎IRI的調控機制

2.2.1 NF-κB對NOD樣受體蛋白3炎癥小體的調控機制NF-κB對下游通路的影響主要是通過細胞焦亡途徑。細胞焦亡是一種炎癥相關的細胞程序性死亡，表現(xiàn)為細胞快速且持續(xù)性增大至細胞膜破裂，常伴隨著NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的增多及大量促炎因子的釋放，進而引起炎癥反應，導致細胞損傷。細胞焦亡是以炎癥小體形成為標志，依賴Caspase-1激活，是一種細胞內和細胞外刺激的適應性免疫。NLRP3作為炎癥小體中研究最多的蛋白，其促進炎癥反應的激活方式可以通過依賴Caspase-1的經典激活途徑和依賴Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11的非經典激活途徑[29]。NF-κB主要作用于依賴Caspase-1的經典激活途徑。在經典激活途徑中，NLRP3在上游信號分子諸如三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、細菌毒素、病毒等刺激下，通過激活TLR/IL-1受體，促進下游NF-κB活化，NLRP3在泛素化后，其N端效應結構域與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC）和Caspase-1前體（pro-Caspase-1）結合，形成多蛋白復合物，活化的Caspase-1切割促炎因子IL-1β前體（pro-IL-1β）和IL-18前體（pro-IL-18），引起IL-1β和IL-18釋放，促進炎癥反應，同時促進Gasdermin D（GSDMD）蛋白剪切為GSDMD-N，導致細胞膜形成小孔，水分內流，細胞腫脹至細胞膜破裂，引起炎癥相關反應，介導細胞焦亡，導致腎IRI[29-31]。

近期有研究指出，轉錄誘導精子形成基因40（transcription-induced spermatogenesis gene 40，Tisp40）、順鉑及葉酸等可通過促進NF-κB磷酸化，促進NLRP3炎癥小體激活，增強腎小管上皮細胞GSDMD介導的細胞焦亡，導致腎IRI[30,32-33]。NF-κB抑制劑小白菊內酯、羥氯喹、蛋白激酶R抑制劑C16、維生素D受體、異丁司特、左歸飲等可以下調NF-κB信號，降低核內NF-κB p65水平，抑制NLRP3信號通路，下調Caspase-1、GSDMD的表達，從而減輕腎IRI[17,30,32-35]。NLRP3作為NF-κB下游因子，與腎IRI密切相關[36-38]，但有關NLRP3炎癥小體對腎IRI的調控機制尚未完全闡明，且尚無針對NLRP3炎癥小體的靶向藥物。未來應針對腎IRI中NLRP3炎癥小體的調控機制進行深入研究，研發(fā)特異性藥物，為臨床上行腎移植及腎部分切除術的患者提供有力的幫助。

2.2.2 NF-κB對缺氧誘導因子-1α的調控機制缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α是對缺氧的適應性反應的主要調節(jié)因子，在腎缺血-再灌注、單側輸尿管梗阻和敗血癥誘導的AKI模型中，HIF-1α在腎小管上表達的轉錄水平顯著增加。HIF-1α的最佳積累依賴于IKKβ，在缺氧條件下，巨噬細胞中的IKK會被激活，誘導IKKα/β和IκBα的磷酸化，促進IκBα降解，NF-κB被激活后，NF-κB p50/p65復合物通過直接與HIF-1α啟動子結合并增強其轉錄，產生的HIF-1α可以防止AKI中的腎小管損傷[39-40]。據文獻報道，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）MALAT1在缺氧條件下，通過與細胞核中的NF-κB相互作用，抑制其DNA活性，同時抑制NF-κB p50/p65復合物與HIF-1α結合，從而減輕腎臟炎癥反應[41]。Yu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧應激后NF-κB信號通路激活，NF-κB p50的DNA結合活性增加，HIF-1α表達增多，同時在HIF-1α依賴的lncRNA中，應激誘導的銀屑病易感性相關RNA基因（psoriasis susceptibility-related RNA gene induced by stress，PRINS）與調節(jié)激活正常T細胞表達和分泌的細胞因子（regulated on activation,normal T-cell expressed and secreted，RANTES） 表達增加，通過形成缺血后炎癥反應介導AKI，即通過 HIF-1α-lncRNA-PRINS-RANTES軸在 AKI中發(fā)揮調節(jié)作用。Han等[43]發(fā)現(xiàn)，采用膜G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體 -1（G protein-coupled bile acid receptor-1，GPCBAR1，TGR5）激動劑膽石酸治療大鼠，可上調水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）和HIF-1α的表達，同時降低NF-κB p65和IL-1β的表達水平。雖然有關HIF-1α的研究較為熱門，但在腎IRI中，HIF-1α對NF-κB的調控機制尚無定論，且暫無針對人體中HIF-1α預處理的藥物和技術，有待對其進行深入研究，從而臨床腎IRI防治提供新的思路。

3 小結與展望

NF-κB家族作為炎癥反應的核心，通過與PARP-1、TLR4、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等 上 游 因子及NLRP3、HIF-1α等下游因子共同作用，在腎IRI中發(fā)揮十分重要的作用。但目前在腎IRI的防治中，有關NF-κB上、下游通路之間的作用機制尚未完全闡明，針對NF-κB上、下游信號通路調控的靶向藥物仍較少，如果未來能對此進行深入研究，將會為臨床上治療腎IRI提供新的方案和方向，也將為腎IRI的防治帶來更多的思考和啟示。