丁苯酞聯(lián)合美多芭對帕金森病伴抑郁模型小鼠黑質(zhì)紋狀體Ⅱ型髓系細胞觸發(fā)受體及小膠質(zhì)細胞炎癥標志物表達的影響

劉 斌，楊浩輝，任 伯，范少凱，毛文靜，王雅楠，吳小坤

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北 唐山 063000)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床上常見于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢步態(tài)障礙等運動癥狀為主要表現(xiàn)，常伴發(fā)抑郁、焦慮、認知障礙等非運動癥狀，其中抑郁癥狀的發(fā)生率高達76%[1]。抑郁的發(fā)生會加大帕金森病患者的身心痛苦，還會導(dǎo)致帕金森病患者的臨床治療效果降低[2]。帕金森病伴抑郁癥狀的病因及發(fā)病機制十分復(fù)雜，可能是多種因素共同參與的結(jié)果，除了神經(jīng)解剖因素、α-突觸核蛋白異常聚集和錯誤折疊、神經(jīng)遞質(zhì)因素，有研究[3-4]報道炎癥反應(yīng)與帕金森病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。炎癥反應(yīng)也與抑郁的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[5]。Ⅱ型髓系細胞觸發(fā)受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的凋亡神經(jīng)元吞噬清除和炎癥反應(yīng)，是小膠質(zhì)細胞中表達量最高的受體之一[6]。目前已經(jīng)證實TREM2在阿爾茨海默病模型中可以促進小膠質(zhì)細胞向M2活化從而保護神經(jīng)細胞[7]，但TREM2在帕金森病伴抑郁發(fā)病機制中的作用尚不清楚。丁苯酞(L-3-丁基苯酞，L-3-n-butylphthalide，L-NBP)是一種小分子化合物，在抗炎及抗氧化方面具有重要作用[8]。研究[9]表明丁苯酞可通過抗氧化應(yīng)激而挽救多巴胺能神經(jīng)元，進而改善帕金森病的相關(guān)臨床癥狀，但確切機制尚不清楚。本研究應(yīng)用制備的帕金森病伴抑郁(Parkinson’s disease depression，PDD)小鼠模型，觀察丁苯酞聯(lián)合美多芭對帕金森病伴抑郁模型小鼠黑質(zhì)紋狀體TREM2及小膠質(zhì)細胞M1型炎癥標志物[白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)]及M2型炎癥標志物[IL-10和精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)]表達的影響，探討丁苯酞聯(lián)合美多芭治療帕金森病伴抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康成年C57BL/6小鼠40只由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，10～12周齡，體重20～30 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2020-0004。小鼠在SPF 級清潔動物實驗室(濕度45%～55%，溫度18 ℃左右)飼養(yǎng)1周，遵照實驗動物3R原則給予人道關(guān)懷。動物實驗方法研究經(jīng)由華北理工大學(xué)動物實驗倫理委員會審批通過(審批號：2020197)。

1.2 主要試劑 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)生產(chǎn)于中國阿拉丁公司；鼠抗TREM2試劑盒生產(chǎn)于Affinity公司；IL-1β、TNF-α、IL-10、Arg-1試劑盒生產(chǎn)于Affinity公司；美多芭(國藥準字H10930198)生產(chǎn)于上海羅氏制藥有限公司；丁苯酞膠囊(國藥準字H20050299)生產(chǎn)于石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組：隨機將40只C57BL/6成年雄性小鼠分為正常對照組(對照組)、帕金森病伴抑郁模型組(模型組)、美多芭治療組和丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組，每組10只。

1.3.2 模型制備：MPTP腹腔注射(30 mg/kg×7 d)制備帕金森病小鼠模型，根據(jù)帕金森病震顫麻痹評分標準篩選出2～3分帕金森病模型小鼠[10]。帕金森病小鼠模型制備成功后，采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生帕金森病伴抑郁小鼠模型，刺激包括禁食、禁水、冷水游泳、熱烘、潮籠、晝夜顛倒、夾尾、束縛等，各項刺激隨機安排，每種刺激重復(fù)2～3次，刺激時間為21 d。通過強迫游泳測試、懸尾測試和糖水偏好實驗對小鼠的抑郁樣行為進行評價[11]，篩選出符合要求的帕金森病伴抑郁模型小鼠進行后續(xù)實驗。

1.3.3 給藥方法：帕金森病伴抑郁小鼠模型制備成功后，給予美多芭治療組小鼠美多芭(6.25 mg/kg)灌胃治療，1次/d，持續(xù)1周；給予丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組小鼠美多芭(6.25 mg/kg)和丁苯酞(120 mg/kg)灌胃治療，1次/d，共治療1周。對照組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液1 ml灌胃，1次/d，共1周。

1.3.4 免疫組化檢測α-突觸核蛋白陽性表達情況：采用免疫組化定性分析黑質(zhì)紋狀體內(nèi)α-突觸核蛋白陽性表達情況，嚴格按說明書要求操作。α-突觸核蛋白陽性細胞計數(shù)標準：目鏡400倍下，選取各組小鼠黑質(zhì)致密部(SNC)3個不重疊視野，核呈淺藍色或紫藍色，胞漿呈棕黃色為陽性細胞，記錄陽性細胞數(shù)量。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定5-羥色胺(5-HT)含量：樣品稱重后加入PBS緩沖液，緩沖液和組織比例為1∶10，充分混合后冰上裂解半小時，在4 ℃環(huán)境下離心15 min，獲得上部清液。根據(jù)試劑盒說明書要求設(shè)標準品孔、空白孔以及待測樣品孔。標準品孔中每孔加入100 μl，待測樣品孔分別加入待測樣品和樣品稀釋液50 μl，接著在各孔中分別加入生物素化抗體工作液50 μl，常溫環(huán)境下孵育2 h，清洗并晾干。再在各孔分別加入100 μl酶結(jié)合工作液，常溫孵育0.5 h，清洗并晾干。然后在各孔中加入100 μl顯色劑，注意避光儲存，在室溫環(huán)境下靜置20 min。最后在各孔中加入100 μl終止液。檢測各孔的光密度(OD)值，波長為450 nm，參考標準曲線換算標準計算樣品濃度。

1.3.6 免疫印跡法(Western blot)檢測相關(guān)蛋白表達情況：操作前1 d小鼠禁食不禁水。待行為檢測完畢后，立即將小鼠斷頭處死，取出整個大腦置于冰上，立即分離出實驗小鼠的黑質(zhì)紋狀體組織，液氮速凍，-80 ℃條件下保存待測。將小鼠黑質(zhì)紋狀體組織剪成小塊，加入蛋白裂解液，提取蛋白質(zhì)，離心提取上清液，取50 μg上清液用于SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用10%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加1∶1000相關(guān)一抗，以β-actin為內(nèi)參，4 ℃ 孵育過夜后TBST緩沖鹽溶液洗滌，根據(jù)一抗種屬加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h 。ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶并拍照。 目的蛋白包括TREM2、IL-1β、TNF-α、IL-10和Arg-1。

1.3.7 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測相關(guān)基因mRNA表達情況：采用TRIzol試劑從小鼠黑質(zhì)紋狀體組織中提取總mRNA。以提取的總mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，采用SYBR Green實時PCR預(yù)混試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄酶 RT-qPCR分析。目的基因特異性引物序列：IL-1β正向為5’-GCAGTGGTTCGAGGCCTAAT-3’，反向為5’-GCTGCTTCAGACACTTGCAC-3’；TNF-α正向為5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’，反向為5’-TGGATGCTCATCAGGACAG-3’；Arg-1正向為5’-TTGGCTTGCTTCGGAACTCA-3’，反向為5’-CATTGTTGCCCAGGTTCAGC-3’；IL-10正向為5’-CAGTACAGCCGGGAAGACAA-3’，反向為5’-AGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3’。 應(yīng)用Nanodrop測量小鼠黑質(zhì)紋狀體組織RNA樣品在260～280 nm的吸收值，計算RNA純度和濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體α-突觸核蛋白檢測結(jié)果 見圖1。對照組小鼠黑質(zhì)紋狀體中有極少量α-突觸核蛋白表達，模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體部位可見大量α-突觸核蛋白異常積聚；美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組α-突觸核蛋白陽性表達明顯減少，染色變淺，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組減少更明顯。

對照組 模型組 美多芭治療組 丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組

2.2 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體5-HT含量比較 見表1。與對照組比較，模型組5-HT含量明顯減低(P<0.05)；與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組5-HT含量明顯增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組增加更明顯(均P<0.05)。

表1 各組黑質(zhì)紋狀體組織5-HT含量比較(μg/L)

2.3 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體TREM2蛋白相對表達水平比較 見表2。與對照組比較，模型組TREM2明顯減低(P<0.05)；與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組TREM2明顯增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組增加更明顯(均P<0.05)。

表2 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體TREM2蛋白相對表達水平比較

2.4 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體M1型促炎因子和M2型抑炎癥因子蛋白相對表達水平比較 見表3。與對照組比較，模型組M1型促炎因子IL-1β和TNF-α蛋白表達升高，M2型抑炎因子IL-10和Arg-1蛋白表達明顯下降(均P<0.05)；與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組M1型促炎因子IL-1β和TNF-α蛋白表達下降，M2型抑炎因子IL-10和Arg-1蛋白表達增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組變化更明顯(均P<0.05)。

表3 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體M1型促炎因子和M2型抑炎癥因子蛋白相對表達水平比較

2.5 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體M1型促炎癥因子和M2型抑炎癥因子mRNA相對表達水平比較 見表4。與對照組比較，模型組M1型促炎因子IL-1β和TNF-α mRNA表達升高，M2型抑炎因子IL-10和Arg-1 mRNA表達明顯下降(均P<0.05)；與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組M1型促炎因子IL-1β和TNF-α mRNA表達下降，M2型抑炎因子IL-10和Arg-1 mRNA表達增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組變化更明顯(均P<0.05)。

表4 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體M1型促炎癥因子和M2型抑炎癥因子mRNA相對表達水平比較

3 討 論

帕金森病主要由黑質(zhì)紋狀體致密部中多巴胺能神經(jīng)元逐漸丟失、α-突觸核蛋白異常聚集和錯誤折疊引起[12-13]。帕金森病患者常伴抑郁，但其發(fā)病機制目前尚不明確。研究[14]發(fā)現(xiàn)主要可能與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及慢性神經(jīng)炎癥等因素造成多巴胺能及5-HT能神經(jīng)元變性出現(xiàn)缺失有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體可見大量α-突觸核蛋白表達及異常積聚，模型組5-HT含量明顯減低。此結(jié)果一方面表明α-突觸核蛋白異常積聚和5-HT能神經(jīng)元變性與帕金森病伴抑郁密切相關(guān)，另一方面也驗證了帕金森病伴抑郁模型制備成功的可靠性。

左旋多巴“替代療法”是治療帕金森病最基本、最主要的方法，但左旋多巴往往只能緩解或改善臨床癥狀。隨著病程進展會出現(xiàn)療效減退，需增加劑量，不良反應(yīng)也將隨之增加，甚至患者的生活質(zhì)量受到嚴重影響。因此，尋找能夠增強左旋多巴療效且能減輕其不良反應(yīng)的藥物是防治帕金森病的探討熱點。丁苯酞是從芹菜和西洋菜種子中提取分離出來的一種小分子化合物，目前臨床上主要用于治療急性缺血性腦梗死，它可通過多種機制來保護神經(jīng)細胞[15-18]。丁苯酞可通過抗氧化應(yīng)激挽救多巴胺能神經(jīng)元，具有神經(jīng)保護作用，可改善帕金森病臨床相關(guān)運動癥狀[19-20]。丁苯酞對抑郁癥狀也有一定的療效[21]，文獻資料[22]表明經(jīng)丁苯酞治療后，帕金森病合并抑郁癥狀患者的漢密爾頓抑郁量表評分較治療前明顯下降。我們的前期實驗研究[23]也證明丁苯酞能夠減輕帕金森病伴抑郁小鼠的抑郁行為。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組α-突觸核蛋白陽性表達明顯減少，染色變淺，5-HT含量明顯增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組減少更明顯，表明丁苯酞聯(lián)合美多芭治療可以減少α-突觸核蛋白的異常積聚，增加5-HT含量，對神經(jīng)元具有保護作用。

免疫炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致帕金森病、阿爾茨海默病等諸多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的重要危險因素[24-25]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細胞驅(qū)動，活化的小膠質(zhì)細胞被認為是促炎因子的主要來源[26]。TREM2是免疫球蛋白超家族的一種跨膜蛋白，其作為一個具有免疫調(diào)節(jié)作用的受體，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞上表達[27]。TREM2參與小膠質(zhì)細胞的增殖、運輸、吞噬作用及炎癥反應(yīng)，在抑制神經(jīng)炎癥方面有重要作用[28]。我們采用Western blott檢測帕金森病伴抑郁小鼠黑質(zhì)紋狀體中TREM2的含量，結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組TREM2表達明顯減低；與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組TREM2表達明顯增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組增加更明顯。此結(jié)果表明丁苯酞聯(lián)合美多芭能促進帕金森病伴抑郁模型小鼠黑質(zhì)紋狀體中TREM2表達的增加。

當神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂時，小膠質(zhì)細胞將被激活，激活后的小膠質(zhì)細胞將發(fā)生一系列形態(tài)和功能轉(zhuǎn)變，包括吞噬功能增強、細胞因子分泌增加[29]。小膠質(zhì)細胞活化可分為兩個表型：具有促炎作用的M1表型，其主要炎癥標志物包括IL-1β、TNF-α等，對神經(jīng)系統(tǒng)具有破壞作用；具有抗炎作用的M2表型，其主要炎癥標志物包括IL-10、Arg-1等，參與神經(jīng)修復(fù)及免疫抑制等過程，對神經(jīng)細胞具有保護作用[30-31]。M1型及M2型炎癥標志物的表達可以反映小膠質(zhì)細胞的激活情況。我們采用Western blot和PCR分別檢測帕金森病伴抑郁模型小鼠黑質(zhì)紋狀體中小膠質(zhì)細胞的IL-1β、TNF-α、IL-10、Arg-1的表達情況，結(jié)果均顯示：與對照組比較，模型組小膠質(zhì)細胞M1型促炎因子IL-1β和TNF-α表達明顯升高，M2型抑炎因子IL-10和Arg-1表達明顯下降；與模型組比較，美多芭治療組及丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組M1型促炎因子IL-1β和TNF-α表達下降，M2型抑炎因子IL-10和Arg-1表達增加，以丁苯酞聯(lián)合美多芭治療組更明顯。

綜上所述，丁苯酞聯(lián)合美多芭能抑制帕金森病伴抑郁模型小鼠黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)，保護神經(jīng)元，從而改善帕金森及抑郁癥狀。