微小RNA-135a-5p和Krüppel樣因子16在胃腺癌中的表達及靶向關系研究

張 鑫，田 蕾，朱金朋，史 璇，李迪諾

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化三病區(qū)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外胃一病區(qū)，遼寧 錦州 121001)

胃腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，來源于胃黏膜腺上皮，腫瘤細胞異型性大、侵襲性強、轉移快，患者預后差[1-2]。近年研究[3]顯示胃癌中存在多種基因、蛋白和遺傳物質的異常表達。Krüppel樣因子 16 (Krüppel-like transcription factor 16，KLF16)是近年學者關注到的與腫瘤形成有關的基因，其不僅具有物種特異性，在機體中還具有器官特異性。有研究[4]發(fā)現(xiàn)KLF16在胃癌中高表達，其可能是促進腫瘤形成的重要因子。微小RNA(microRNA，miR)與多種惡性腫瘤相關，主要通過與靶基因3’UTR結合調控靶基因，發(fā)揮生物學作用[5]。課題組前期應用二代測序技術發(fā)現(xiàn)KLF16在胃癌中高表達，并應用生物信息技術發(fā)現(xiàn)KLF16與微小RNA-135a-5p(microRNA-135a-5p，miR-135a-5p)具有可能結合的堿基序列。本研究探討胃腺癌中miR-135a-5p和KLF16的表達特征，并分析兩者的靶向關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月至2022年5月在我院就診并確診為胃腺癌的患者45例為研究對象，其中男性23例，女性22例；年齡32～82歲，中位年齡60歲；高分化5例，中分化10例，低分化30例；有脈管癌栓16例，無脈管癌栓29例；有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移24例。病例納入標準：經胃鏡活檢組織病理確診為胃腺癌后行根治性手術治療，術后30 min內取材行病理學檢查，并經2位病理科主治醫(yī)師復核切片再次明確；符合WHO診斷標準；臨床資料完整。排除標準：雙原發(fā)癌或多原發(fā)癌；術前有放療或化療史。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 材料與試劑 腫瘤組織和距腫物邊緣>3 cm正常胃黏膜組織新鮮標本(-80 ℃凍存)和石蠟包埋標本；人胃癌細胞株MGC-803和SGC-7901、人正常胃細胞株GES-1購自中科院上海細胞庫；TRIzol、DEPC、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自上海碧云天公司；質粒均由上海生工公司合成；Lipofectamine 2000試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、KLF16濃縮液(批號：Ag20503)購自武漢三鷹公司；二抗、DAB均購自武漢博士德生物公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：人胃癌MGC-803和SGC-7901細胞株、人正常胃GES-1細胞株均用含有10% FBS與1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉染：取處于對數(shù)生長期的人胃癌細胞株MGC-803，以105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞整合度為75%時用Lipofectamine 2000進行轉染，分別建立si-KLF16組和miR-135a-5p mimic組，并設立無關序列組。

1.3.3 miR-135a-5p和KLF16 mRNA表達量檢測：采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進行檢測。TRIzol提取總RNA，檢測純度后逆轉錄獲得cDNA。miR-135a-5p正向引物序列為5’-AGTGAAACCGCTATCGACGTGGCGCT-3’， 反向引物序列為5’-CCAACGTGTGGAAATCACGTAGGACG-3’。KLF16 mRNA正向引物序列為5’-GTGAACATTAACTTGCACACGT-

CGG-3’， 反向引物序列為5’-GGACGCGTGGCGTGTCCGACGTTATG-3’。以U6作為內參，正向引物序列為5’-CCTCGTTCTTCGCACATATACACA-3’， 反向引物序列為5’-TAACGGTGCAGCCGAGG-TATCGT-3’。執(zhí)行PCR程序設定：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，相對表達量以2-ΔΔCt法計算。

1.3.4 免疫組化染色：基于術后石蠟包埋標本進行實驗。KLF16為濃縮液，先梯度稀釋后行預實驗，選擇顯色最好的1∶200進行正式實驗。應用免疫組化Envision法檢測KLF16的表達，嚴格按實驗步驟操作，DAB顯色。結果由2位病理主治醫(yī)師雙盲閱片后得出。先在低倍鏡(100倍)下選擇顯色密集且良好的上皮細胞區(qū)域，然后在高倍鏡(200倍)下觀察并計數(shù)，共觀察5個視野。顯色強度評分：無著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強著色為3分。陽性率評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分[6]。兩者相乘為最終評分，總分范圍0～12分，≤5分為陰性，>5分為陽性。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因實驗：構建含有野生型KLF16的質粒(WT-KLF16)和突變型KLF16的質粒(MT-KLF16)，分別與miR-135a-5p mimic、miR-135a-5p空白對照組(NC)進行共轉染，觀察螢火蟲發(fā)光值和海腎發(fā)光值(對照)。相對熒光素酶活性=螢火蟲發(fā)光值/海腎發(fā)光值×100%。

2 結 果

2.1 正常胃黏膜與胃腺癌組織miR-135a-5p表達、KLF16陽性情況比較 見表1(圖1)。胃腺癌組織中miR-135a-5p表達量明顯低于正常胃黏膜組織，KLF16陽性率明顯高于正常胃黏膜組織(均P<0.05)。

表1 正常胃黏膜與胃腺癌組織miR-135a-5p表達、KLF16陽性情況比較

圖1 在正常胃黏膜(A)和胃腺癌(B)組織KLF16免疫組化染色結果(×200)

2.2 不同臨床病理特征胃腺癌患者miR-135a-5p表達量及KLF16陽性表達情況比較 見表2。不同腫瘤最大徑和浸潤深度胃腺癌患者miR-135a-5p相對表達量及KLF16陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表2 不同臨床病理特征胃腺癌患者miR-135a-5p表達量及KLF16陽性表達情況比較

2.3 胃腺癌組織miR-135a-5p表達與KLF16陽性的相關性 線性相關分析顯示，miR-135a-5p表達與KLF16陽性呈負相關(r=-0.623，P=0.001)。

2.4 MGC-803、SGC-7901與GES-1細胞株miR-135a-5p、KLF16 mRNA表達比較 見表3。胃癌細胞株MGC-803、SGC-7901細胞株miR-135a-5p表達明顯低于正常胃GES-1細胞株，KLF16 mRNA表達明顯高于GES-1細胞株(均P<0.05)。

表3 MGC-803、SGC-7901與GES-1細胞株miR-135a-5p、KLF16 mRNA表達比較

2.5 MGC-803 si-KLF16組與無關序列組miR-135a-5p表達比較 基于MGC-803細胞株，應用qRT-PCR檢測miR-135a-5p表達，結果顯示si-KLF16組中miR-135a-5p表達明顯高于無關序列組(1.98±0.38與1.22±0.18，t=4.323，P=0.013)。

2.6 雙熒光素酶報告基因實驗結果 見圖2?；贛GC-803細胞株，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-135a-5p mimic+WT-KLF16與NC+WT-KLF16、miR-135a-5p mimic+MT-KLF16、NC+MT-KLF16比較，相對熒光素酶活性下降(均P<0.05)，提示miR-135a-5p和KLF16具有靶向關系。

注：與miR-135a-5p mimic+WT-KLF16比較，*P<0.05

3 討 論

KLFs主要通過與富含GC序列中的多個基因啟動子結合發(fā)揮調控作用，其家族每個成員的N端均具有特異性區(qū)域，因此其功能各異[7]。KLF16的功能不僅與家族中其他成員不完全相關，而且表現(xiàn)出明顯的器官特異性[8-9]。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，KLF16上調時對肺腺癌、鱗癌形成有抑制作用。但有研究[12]在前列腺癌的組織學實驗中發(fā)現(xiàn)KLF16表達增高，并認為KLF16對前列腺癌形成有促進作用。

本研究顯示，胃腺癌組織中miR-135a-5p低表達，KLF16高表達，并在組織學和細胞學研究中均得到證實，提示miR-135a-5p和KLF16異常表達是胃腺癌形成中的重要分子事件，這與Ma等[13]研究結果一致。本研究中，miR-135a-5p和KLF16在胃腺癌不同腫瘤最大徑、不同浸潤深度表達的比較中差異有統(tǒng)計學意義，提示兩者異常表達對腫瘤生長、侵襲等生物學行為有促進作用。另外，miR-135a-5p和KLF16具有靶向負調控關系，提示miR-135a-5p對胃腺癌的調控是通過靶基因KLF16實現(xiàn)的。

KLF16是miR-135a-5p/KLF16通路中調控胃癌的主要靶基因，其活化后可能有以下作用：①促進細胞增殖。有學者[7]發(fā)現(xiàn)敲除KLF16能直接抑制腫瘤細胞的增殖，引起腫瘤細胞增殖活性下降，腫瘤生長緩慢。而在KLF16上調時能通過lamin B2等基因促進腫瘤細胞的增殖[14]。顧清等[15]通過觀察KLF16對胃癌細胞增殖和克隆能力的影響發(fā)現(xiàn)，KLF16對細胞增殖的作用可能與調控P21和細胞周期蛋白素依賴性激酶4(CDK4)有關，并證實了P21蛋白通過其N末端特異性地與增殖細胞核抗原、Cyclin-CDK結合，抑制CDK活性，阻滯細胞周期，進而抑制細胞增殖；同時發(fā)現(xiàn)CDK4蛋白正向調控細胞周期，促進細胞由G1期向S期轉化。②抑制細胞凋亡。KLF16能直接抑制細胞凋亡，如對凋亡因子Bax和Bcl-2的調控作用，使腫瘤細胞具有永生化的特征[11]。有研究[16]顯示KLF16能通過維甲酸結合蛋白-2活化整合素β1/黏著斑激酶/細胞外信號調節(jié)激酶途徑抑制細胞凋亡。有學者[8]通過觀察人膠質瘤U87細胞中KLF16的表達發(fā)現(xiàn)，KLF16能抑制U87細胞凋亡。因此，KLF16加速腫瘤細胞增殖及抑制凋亡可能是其經典作用，因此趙舒楊等[9]通過應用龍葵堿聯(lián)合沉默KLF16基因觀察對膠質瘤的增殖和凋亡的作用，證實了龍葵堿聯(lián)合沉默KLF16基因對膠質瘤細胞增殖和凋亡的調控效果。③促進侵襲和遷移。研究[17]顯示KLF16能通過下調轉化生長因子受體3促進腫瘤細胞的增殖和遷移，使腫瘤細胞黏附性下降，細胞遷移能力增強。也學者[18]發(fā)現(xiàn)，KLF16能通過調控BCL2樣15促凋亡蛋白促進腫瘤細胞遷移。KLF16是miR-135a-5p下游基因，基于兩者的關系進行干預研究可能對闡明胃腺癌的形成和進展提供重要支持。miR-135a-5p作為腫瘤細胞形成中的直接啟動基因，可引起腫瘤細胞異型增生和遷移[19-20]，這是一種直接作用。但是多種研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p的調控是通過多種下游通路實現(xiàn)的，其作用可能更復雜。張莉等[23]在甲狀腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p能通過介導硫氧還蛋白互作蛋白發(fā)揮調控腫瘤進展的作用。張夢等[24]在子宮頸鱗癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p可能與GATA結合蛋白3、信號轉導和轉錄激活因子3的作用有關聯(lián)。miR-135a-5p通過下游因子在非腫瘤中對凋亡的調控也有研究報道。例如，謝九冰等[25]發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p在青光眼視網膜神經節(jié)細胞中低表達，且miR-135a-5p高表達能降低青光眼視網膜神經節(jié)細胞的凋亡，認為其機制可能是通過調控 miR-135a-5p/Bcl-2/Bax軸實現(xiàn)的。

綜上所述，胃腺癌miR-135a-5p低表達，KLF16高表達，它們都參與腫瘤的形成和進展，且具有靶向關系?；趍iR-135a-5p/KLF16的調控作用可能是胃癌形成的關鍵作用，其上游、下游調控網絡復雜，后續(xù)將重點進行此方向的研究，同時關注其干擾因素及干預措施，對揭示miR-135a-5p/KLF16在胃腺癌中的具體機制有重要價值。