Maresin1對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用及機制研究

李 澤，單 偉，姜 東

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

糖尿病腎病(Diabetes kidney disease，DKD)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是全球終末期腎病的主要原因[1-2]。DKD沒有特異性治療方法，預(yù)后通常較差。因此，有必要進(jìn)一步探索DKD的病理生理機制和臨床治療策略。高血糖誘導(dǎo)的血管功能障礙是DKD的主要起始機制，但其進(jìn)展也由一組異質(zhì)性病理機制驅(qū)動，包括炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化等[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，針對炎癥機制進(jìn)行干預(yù)可有效防治DKD。由巨噬細(xì)胞合成的Maresin1具有強大的抗炎及消退炎癥作用，對多種疾病(如肺部疾病、肝臟疾病、血管疾病、膿毒癥等)均具有較好的療效[5-6]。有文獻(xiàn)[7]報道，DKD受試者血液中Maresin1明顯低于對照組。此外，其可通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤和增強膿毒癥急性肺損傷小鼠模型中的巨噬細(xì)胞吞噬作用來促進(jìn)炎癥消退，從而減少急性肺損傷[8]。然而，Maresin1是否緩解DKD發(fā)生和發(fā)展尚未得到充分闡明。核因子-κB(Nuclear factor κB，NF-κB)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路可以加重DKD炎癥反應(yīng)，但Maresin1是否能調(diào)控NF-κB/STAT3進(jìn)而改善DKD尚未見報道。因此，本研究利用SD大鼠糖尿病模型探索Maresin1對DKD的保護(hù)作用及相關(guān)機制，為臨床治療DKD提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體重200～240 g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，禁食、禁水12 h。本實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠模型制備：單次腹腔注射鏈脲佐菌素(批號：S0130，Sigma公司)55 mg/kg，3 d后血糖≥16.7 mmol/L為成模。

1.2.2 大鼠分組：將大鼠分為四組，每組10只。對照組(Control組)不做任何處理；糖尿病組(DM組)為單純模型組；Maresin1預(yù)處理組(DM+Maresin1組)在成模8周后進(jìn)行4 ng/g Maresin1(批號：10878-10,Cayman Chemical公司)腹腔注射給藥，每周2次[9]；DM+Maresin1+colivelin組在DM+Maresin1組基礎(chǔ)上給予STAT3激活劑colivelin(批號：HY-P1061A,MCE公司)2 mg/(kg·d)腹腔注射。

1.2.3 標(biāo)本采集：12 周后，用戊巴比妥鈉(10 g/L)麻醉大鼠，在灌注固定前從心臟取血，留取血清用于血糖、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)和血清炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6]檢測。大鼠采用4%多聚甲醛灌流1.5～2 h，取腎臟放于4 ℃固定液中48 h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，用于HE染色、Masson染色和PAS染色(試劑盒批號：G1120、G1340、G1281，Solarbio公司)。同時，取大鼠新鮮腎臟組織進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.4 血清血糖、Scr和BUN檢測：采用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 血清炎癥因子水平檢測：將收集的上清在4 ℃條件下以12000 r/min離心20 min。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(批號：SEKR-0009，Solarbio公司)說明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并加樣品，以450 nm波長測光密度(OD)值。

1.2.6 HE染色：石蠟切片(5 μm)脫蠟后PBS洗3次，加蘇木素反應(yīng)2 min，自來水沖洗。加伊紅反應(yīng)1 min，自來水沖洗。脫水透明后封片，顯微鏡(BX53，Olympus公司)下拍照觀察。

1.2.7 Masson染色及PAS染色：石蠟切片(5 μm)脫蠟后，按照試劑盒說明書進(jìn)行Masson和PAS染色，光鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)、腎臟纖維化、系膜基質(zhì)增生程度。

1.2.8 相關(guān)蛋白Western blot檢測：采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，1% BSA封閉2 h。加入核NF-κB p65(1∶5000)、p-STAT3(1∶2000)、β-actin(1∶5000)于4 ℃孵育過夜。18 h后TBST洗膜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，ECL顯影，用Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠血糖、Scr及BUN水平比較 見圖1。與Control組相比，DM組血糖、Scr及BUN水平明顯增加(均P<0.05)。與DM組相比，DM+Maresin1組Scr及BUN水平明顯降低(均P<0.05)。與DM+Maresin1組相比，DM+Maresin1+colivelin組Scr及BUN水平有所增加(均P<0.05)。 然而，DM組、DM+Maresin1組和DM+Maresin1+colivelin組血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

注：與Control組相比，*P<0.05，▲P<0.01；與DM組相比，#P<0.05；與DM+Maresin1組相比，△P<0.05

2.2 四組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果 見圖2。Control組腎組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，未見明顯損傷性改變。DM組和DM+Maresin1+colivelin組可見腎小球肥大，腎小管明顯擴張，間質(zhì)散在炎性細(xì)胞浸潤。DM+Maresin1組腎組織損傷程度較DM組和DM+Maresin1+colivelin組減輕。

Control組 DM組 DM+Maresin1組 DM+Maresin1+colivelin組

2.3 四組大鼠Masson染色結(jié)果 見圖3。Control組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)未見異常。DM組和DM+Maresin1+colivelin組可見腎小管間質(zhì)和腎小球周圍呈現(xiàn)膠原堆積，均存在明顯的纖維化現(xiàn)象。與DM組相比，DM+Maresin1組腎小管間質(zhì)的纖維化程度降低。

Control組 DM組 DM+Maresin1組 DM+Maresin1+colivelin組

2.4 四組大鼠PAS染色結(jié)果 見圖4。Control組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)未見異常。DM組和DM+Maresin1+colivelin組可見大量糖原沉積，提示系膜基質(zhì)增生。與DM組相比，DM+Maresin1組的上述變化減輕。

Control組 DM組 DM+Maresin1組 DM+Maresin1+colivelin組

2.5 四組大鼠腎組織NF-κB/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見圖5。與Control組相比，DM組NF-κB p65及p-STAT3表達(dá)明顯增加(均P<0.05)。與DM組相比，DM+Maresin1組NF-κB p65以及p-STAT3明顯降低(均P<0.05)。與DM+Maresin1組相比，DM+Maresin1+colivelin組NF-κB p65及p-STAT3有所增加(均P<0.05)。

注：左圖為電泳圖。與Control組相比，*P<0.05，▲P<0.01；與DM組相比，◇P<0.01，#P<0.05；與DM+Maresin1組相比，△P<0.05

2.6 四組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 見圖6。與Control組相比，DM組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯增加(均P<0.05)。與DM組相比，DM+Maresin1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(均P<0.05)。與DM+Maresin1組相比，DM+Maresin1+colivelin組TNF-α、IL-1β、IL-6水平有所增加(均P<0.05)。

注：與Control組相比，*P<0.05，▲P<0.01；與DM組相比，#P<0.05；與DM+Maresin1組相比，△P<0.05

3 討 論

炎癥是對抗身體感染和損傷的重要防御機制，但過度不受控制的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致自身組織細(xì)胞的非特異性殺傷。為了限制炎癥的過度發(fā)展，促進(jìn)炎癥的及時消退，機體內(nèi)部會產(chǎn)生一系列抗炎的脂質(zhì)介質(zhì)，這些介質(zhì)又稱炎癥的“剎車信號”。腎臟是糖尿病最常受累的器官之一，DKD是糖尿病患者死亡風(fēng)險增加的獨立危險因素[10-11]。

本實驗結(jié)果表明，DM組腎組織損傷明顯，血清中血糖、Scr和BUN水平升高，血清中炎癥因子明顯增加，表明DKD模型建立成功，這為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

由巨噬細(xì)胞合成的Maresin1是一種廣泛的抗炎劑，在多種急性和慢性炎癥疾病中起作用[12-13]。本究表明，Maresin1降低了糖尿病大鼠模型中的Scr及BUN水平，但對血糖的調(diào)節(jié)無明顯效果。此外，應(yīng)用HE染色檢測腎臟病理結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎小球肥大，腎小管明顯擴張，間質(zhì)散在炎性細(xì)胞浸潤，而Maresin1治療后以上腎組織損傷程度均較DM組減輕。Masson染色和PAS染色也顯示，腎小管間質(zhì)和腎小球周圍呈現(xiàn)膠原堆積，糖原沉積，存在明顯纖維化及系膜基質(zhì)增生，而Maresin1治療后以上變化均較DM組減輕。研究[14]證實，Maresin1具有控制炎癥性疾病的能力，這在很大程度上與其能夠減少幾種促炎細(xì)胞因子的能力有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，Maresin1治療后糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低。以上結(jié)果顯示，Maresin1對糖尿病大鼠的腎臟損傷具有較好的抑制作用。

NF-κB活化是炎癥級聯(lián)反應(yīng)在糖尿病腎病發(fā)展中的關(guān)鍵機制[15-16]。NF-κB的磷酸化釋放NF-κB p50/p65亞基，導(dǎo)致靶基因的核積累和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Maresin1可抑制NF-κB的活化，表現(xiàn)出強大的抗炎活性[17]。在正常情況時，NF-κB是與抑制劑IκB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中的無活性三聚體，沒有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，它們誘導(dǎo)NF-κB激酶活化，其降解IκB并磷酸化p65亞基并將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[18-19]。以前的研究描述了Maresin1在抑制不同動物模型NF-κB激活中的作用。在本項研究中，我們通過Western blot檢測了NF-κB p65的表達(dá)，p65是NF-κB途徑下游的關(guān)鍵活性因子，在腎臟組織中NF-κB p65表達(dá)明顯增加，而Maresin1處理后有效抑制了p65的磷酸化。此外，在Maresin1處理后，大鼠血清中的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6隨著NF-κB的抑制而改變。ELISA結(jié)果顯示，Maresin1治療顯著降低了糖尿病大鼠中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，這表明Maresin1對糖尿病大鼠的保護(hù)作用可能至少部分與NF-κB途徑的抑制有關(guān)。

STAT3蛋白參與各種生理功能的調(diào)節(jié)，如凋亡、炎癥等[20]。STAT3是IL-6細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的主要下游信號靶標(biāo)，在IL-6介導(dǎo)的炎癥和免疫中起關(guān)鍵作用[21]。本研究表明，Maresin1可以通過降低IL-6表達(dá)和STAT3的磷酸化來發(fā)揮對糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用。另外，Maresin1可以明顯抑制糖尿病大鼠腎臟中鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的STAT3，這表明STAT3途徑可能與Maresin1對大鼠DKD的保護(hù)作用有關(guān)。為了進(jìn)一步驗證STAT3在本研究中的作用，在給予Maresin1處理的同時，我們同時給予STAT3信號激活劑colivelin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Maresin1的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)，這提示Maresin1對糖尿病大鼠的保護(hù)作用與抑制STAT3密切相關(guān)。

綜上所述，Maresin1通過抑制NF-κB/STAT3信號通路誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DKD大鼠發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。該結(jié)果為DKD患者發(fā)現(xiàn)了一種新的基于Maresin1的治療方法。然而，Maresin1對DKD的保護(hù)作用機制復(fù)雜，在后續(xù)的科研工作中我們將從蛋白互作的角度繼續(xù)探討Maresin1對NF-κB/STAT3的直接調(diào)控機制。