高乳糖飲食疊加水平臺法脾虛證模型研究與評價

盧夢雄 黃金科 王一帆 薛 紅 王鳳云 唐旭東,

(1 北京大學(xué)中醫(yī)藥臨床醫(yī)學(xué)院(西苑)，北京，100091； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京，100091)

脾是中醫(yī)臟象理論的重要組成部分，脾的生理功能主要體現(xiàn)在主運化谷食水飲，主統(tǒng)血，在體合肉，主四肢[1]。為驗證模型成功與否，現(xiàn)代研究者依據(jù)脾的功能和特性，用相應(yīng)的生物化學(xué)等指標類比。脾主運化的功能以尿D-木糖排泄率或血清D-木糖吸收率作為輔助實驗室參考指標[2]，脾主統(tǒng)血則類比到凝血功能的異常，如血小板數(shù)量下降[3]，在體合肉，主四肢則被闡釋為骨骼肌生理功能的異常，表現(xiàn)在抓力、腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)水平、糖原水平下降等方面[4-6]，也有報道胃蛋白酶原和胃促生長素水平的降低[7-8]。但目前對特定模型的評價指標多較單一，不全面，且對造模過程中指標動態(tài)變化掌握頗少。

目前脾虛證造模方法多類比脾虛證的致病因素。脾虛證的致病因素有：飲食失節(jié)，損傷脾胃；過于勞神，損傷脾氣；素稟不足或年老體衰；過服苦寒瀉下藥物，損傷脾陽；他臟病變影響脾運等。相應(yīng)的造模方法則有苦寒瀉下法、耗氣破氣法、飲食失節(jié)法、飲食偏嗜法、勞倦過度法等。有些造模方法采用單一因素或患者不常接觸因素，如大黃、番瀉葉等，不能真實反映現(xiàn)代人群脾虛證的成因。

東亞人群成年后乳糖酶活性缺乏，乳糖不能被消化、吸收，出現(xiàn)腹痛、腹脹、腹瀉、腸鳴等癥狀，稱為乳糖不耐受[9-11]，此癥狀與脾虛證類似，而隨著近些年乳制品消費增加，乳糖不耐受在我國發(fā)病逐漸增加[11-13]，用高乳糖飲食造模切合實際?，F(xiàn)今人群普遍工作時間長，飲食不規(guī)律，在饑餓與過飽間頻繁轉(zhuǎn)換，因此勞倦過度和飲食失節(jié)是脾虛證重要的致病因素。本模型基于課題組前期工作[14-15]，用高乳糖飼料飼喂既是飲食偏嗜，又是瀉下之法，用水平臺站立法模擬勞倦過度，用不定時投喂來模擬飲食失節(jié)，是所謂復(fù)合因素法，能夠更好模擬現(xiàn)代脾虛證人群真實情況。為避免普通飼料中不可控因素對實驗結(jié)果的影響，使用美國營養(yǎng)學(xué)會(American Institute of Nutrition，AIN)制定的AIN-93G純化飼料作為基本飼料[16]，以滿足大鼠生長發(fā)育所需營養(yǎng)，并在保證各大營養(yǎng)素總量不變的基礎(chǔ)上設(shè)計高乳糖飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級雄性SD大鼠42只，7周齡，體質(zhì)量(260±20)g，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。實驗動物使用許可證：SYXK(京)2018-0018。常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每日日光燈照射(08：00-20：00)，室內(nèi)溫度(22±2)℃。本研究涉及動物實驗經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動物倫理委員會批準(倫理審批號：2019XLC004)。

1.1.2 試劑與儀器 40%高乳糖飼料和標準AIN-93G標準飼料，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。配方見表1。D-木糖(北京酷來搏科技有限公司，貨號：CX12001-100G)，D-木糖試劑盒(Cohesionbio公司，英國，貨號：CAK1238)，大鼠胃蛋白酶原酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：34607)，大鼠饑餓素酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：30838)，三酰甘油(Triacylglycerol，TG)生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：30371S)，腺苷三磷酸生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：30726S)，肌糖原生化試劑盒(艾恩斯生物科技有公司，貨號：34667S)。水環(huán)境小平臺站立箱(112 cm×62 cm×41 cm)箱體，設(shè)置15個小平臺，平臺直徑8 cm，高10 cm，平臺周邊注水，水深2 cm，水溫保持(20±2)℃(自制)。高速冷凍離心機(Siemens公司，德國，型號：Z326K)，酶標儀(Biotek公司，美國，型號：Synergy LX)，大小鼠抓力測定儀(上海移數(shù)信息科技有限公司，型號：YLS-13A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數(shù)字表法將42只SD大鼠分為7組，其中正常組12只，模型大鼠分為造模2周組、造模3周組、造模4周組，每組6只，造模2周停造1周組、造模3周停造1周組、造模4周停造1周組，每組4只。正常組給予標準配方飲食。模型SD大鼠給予40%高乳糖飼料，并且每日17：00至次日8：00放入水平臺中，不定時給予食物。分別于2周、3周、4周處死6只造模2周組、造模3周組、造模4周組大鼠和4只正常組大鼠，造模2周停造1周組、造模3周停造1周組、造模4周停造1周組停止造模1周，觀察后處死。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 體質(zhì)量測定 每天觀察動物毛發(fā)神態(tài)活力，每周稱量動物體質(zhì)量。

1.2.2.2 糞便含水量測定 每周1次收集大鼠濕便稱重，放入37 ℃烘箱中烘烤24 h，干便稱重，含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.2.3 抓力測定 每組大鼠每周進行1次抓力測定，連續(xù)測3次，取平均值。

1.2.2.4 血清D-木糖含量測定 取材時按1 mL/100 g劑量給大鼠灌胃3% D-木糖溶液，2 h后麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min，離心半徑18 cm，離心15 min取血清，用分光光度法測定。

1.2.2.5 血清胃蛋白酶原酶、胃促生長素、三酰甘油測定 分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗法和分光光度法測定。

1.2.2.6 肌肉ATP、糖原測定 取大鼠左后腿腓腸肌液氮冷凍備用，分光光度法測定ATP、糖原含量。

1.2.2.7 小腸病理學(xué) 取大鼠幽門下15 cm腸段，用0.9%氯化鈉溶液洗凈放入多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。觀察小腸絨毛和腺體病理形態(tài)。

1.2.2.8 脾虛證判定 依據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會脾胃病分會發(fā)布的《脾虛證中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》中脾虛證診斷標準[17]，高乳糖飼喂復(fù)合因素法大鼠模型脾虛證判定：溏稀便或水樣便，腸道脹氣，體質(zhì)量增加緩慢或減輕，納呆、少動、皮毛干枯少光、抓力下降等。

2 結(jié)果

2.1 一般體征 正常組大鼠皮毛光亮，肛門干凈，精神良好，活動度正常，糞便顆粒分明，體質(zhì)量增長正常。大鼠給予高乳糖飼料1～2 d后出現(xiàn)明顯黃色水樣稀便，并且隨著造模時間的延長，皮毛逐漸變黃凌亂，失去光澤，肛周出現(xiàn)污穢，倦臥瞇眼，活動度差，體質(zhì)量增長緩慢甚至下降。但從第3周開始出現(xiàn)水樣便癥狀的緩解，個別出現(xiàn)成形便，體質(zhì)量也出現(xiàn)增長趨勢。

2.2 各組體質(zhì)量比較 從造模開始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組的平均體質(zhì)量差距逐漸變大，造模3周組差距達到最大，體質(zhì)量增長最緩慢。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.3 各組抓力比較 從造模開始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組抓力差距漸大，造模3周組達到最大。見圖2。

圖2 各組大鼠抓力比較

2.4 各組糞便含水量比較 從造模開始，造模2周組、造模3周組、造模4周組和正常組的糞便含水量差距逐漸變大，造模2周組差距達到最大，而后回落，到造模4周組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組糞便含水量比較

2.5 各組血清D-木糖水平比較 血清D-木糖水平，造模2周組較正常組明顯降低(P<0.001)，造模2周停造1周組則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模3周組和造模3周停造1周組較正常組升高(P<0.01，P<0.05)，造模4周組和造模4周停造1周組較正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組血清D-木糖水平比較

2.6 各組血清胃蛋白酶原水平比較 各組較正常組血清胃蛋白酶原水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組血清胃蛋白酶原水平比較

2.7 各組血清胃促生長素水平比較 造模3周停造1周組血清胃促生長素水平較正常組降低(P<0.05)，造模3周組和造模3周停造1周組、造模4周停造1周組較造模2周組顯著降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組血清胃促生長素水平比較

2.8 各組血清三酰甘油水平比較 造模2周停造1周組和造模3周組血清三酰甘油水平較正常組和造模2周組增加(P<0.05)，其余組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 各組血清三酰甘油水平比較

2.9 各組肌肉ATP水平比較 各組與正常組之間肌肉ATP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但造模2周停造1周組、造模3周停造1周組較造模2周組顯著降低(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組肌肉ATP水平比較

2.10 各組肌肉糖原水平比較 造模2周停造1周組糖原含量較正常組和造模2周組減少(P<0.05)。見圖9。

圖9 各組肌肉糖原水平比較

2.11 各組血小板計數(shù)比較 造模3周組血小板計數(shù)較正常組明顯減少(P<0.001)，其余組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖10。

圖10 各組血小板計數(shù)比較

2.12 各組紅細胞計數(shù)比較 造模2周組、造模3周組、造模4周組紅細胞計數(shù)較正常組明顯增加，各停造1周組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖11。

圖11 各組紅細胞計數(shù)比較

2.13 各組小腸病理 正常組小腸絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，密度適中，底部腺體發(fā)達。與正常組比較，造模2周組小腸絨毛凌亂，結(jié)構(gòu)破損，但依稀能看出絨毛形態(tài)。造模3周組小腸絨毛結(jié)構(gòu)完全破壞，堆疊。造模4周組小腸絨毛形態(tài)較清晰，但密度稀松。見圖12。

圖12 各組小腸病理比較(HE染色，×100)

3 討論

脾虛證模型從1979年北京師范大學(xué)生物系消化生理科研組用大黃水煎劑灌胃昆明種小白鼠以來[18]，產(chǎn)生出眾多的造模方法，最終都落腳在動物表現(xiàn)出脾主運化、脾主升舉、脾主統(tǒng)血等功能的降低，對應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的消化吸收功能不足、能量代謝低下、機體狀態(tài)衰退等臨床綜合征[19]。學(xué)界較為公認的評價指標是D-木糖水平測試，但此指標并不能完全覆蓋所有模型，因此有必要對動物模型進行系統(tǒng)評價。課題組已建立高乳糖疊加水平臺法所致脾虛證模型[20]，本研究則在此基礎(chǔ)上增加饑飽失常造模因素，使之更符合真實世界的情況，并且已有模型評價指標局限于血清D-木糖水平，只能代表脾主運化的功能，本研究則對脾的主要功能的代表性指標都進行了檢測，廣泛評價本模型的適用性。脾虛是個動態(tài)的過程，不同功能明顯減弱的時間節(jié)點不同，本研究也進行了時間上的探索。

從一般體征來看，造模3周組脾虛證最明顯，造模4周組精神和活動度等逐漸好轉(zhuǎn)。從體質(zhì)量來說，造模3周組較正常組下降最多，造模4周組與正常組差異逐漸縮小。在抓力和糞便含水量方面，也是造模3周組最為明顯，造模4周組則有回升之勢。

根據(jù)分子生物學(xué)和病理學(xué)來看，則出現(xiàn)結(jié)論的分化。從血清D-木糖水平來看，造模2周組降低最為明顯，提示吸收功能的下降，造模3周組反而升高。從血清TG水平來看，造模3周組增加最為明顯，提示脾虛運化脂質(zhì)的能力不足，導(dǎo)致其在血液中累積[21]。在血小板計數(shù)上，造模3周組明顯降低，提示3周為脾主統(tǒng)血功能下降的最優(yōu)時間節(jié)點。在紅細胞計數(shù)上，各造模組均較正常組高，可能是由于腹瀉一直處于體液失衡狀態(tài)，也可能是因為能量供應(yīng)不足而代償性升高以增加供氧。小腸病理顯示，造模2周組到造模3周組結(jié)構(gòu)破壞逐漸嚴重，而造模4周組有所恢復(fù)，提示大鼠對單一濃度乳糖的耐受過程。其余指標差異不明顯可能是由于本研究樣本量較小，也可能與相關(guān)文獻中造模方法與本研究不同有關(guān)。停止造模后1周，大鼠各類指標反彈，為后續(xù)用藥干預(yù)研究提供了參考，即造模與給藥必須同時進行。

本模型在不同指標上的表現(xiàn)不一致。在脾虛證的一般體征表現(xiàn)和“脾主統(tǒng)血”方面，造模3周組最為明顯，而在代表“脾主運化”的D-木糖吸收率上則是造模2周組最為明顯。這提示脾虛證的動態(tài)過程，即脾的不同功能的降低有先后，本模型的致病因素從影響“脾主運化”功能進而影響到其他功能。

綜上所述，本研究用單一高濃度乳糖飲食疊加水平臺站立與飲食失節(jié)法干預(yù)成功建立大鼠脾虛證模型，在2周時“脾主運化”功能降低明顯，在3周時有最明顯脾虛證體征和“脾主統(tǒng)血”功能降低，生化和病理的部分證據(jù)也支持此結(jié)論。