熒光定量PCR在藥用植物基因表達及鑒別中的應用

李柯帆 王 楓 丁 雯 李曉蘭 杜晨暉 閆 艷 裴香萍

(1 山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，太原，030619； 2 山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原，030006)

化學定量分析方法由重量分析、容量分析與儀器分析3部分組成。其中儀器分析方法已廣泛應用于中藥化學成分分離與鑒別、藥代動力學研究中的活性成分檢測、中藥材與中成藥質(zhì)量控制等。核酸作為生命的最基本物質(zhì)之一，對于藥用植物的生長以及活性成分的合成過程至關重要，關于中藥化學成分的分析方法已建立較為成熟的體系，而目前常用分子定量技術對核酸進行定性定量的研究。

分子定量技術包括實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)和數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)。其中qRT-PCR技術為實現(xiàn)核酸定性定量研究奠定基礎，qRT-PCR技術是通過在PCR體系中加入熒光結(jié)合集團或熒光探針，利用熒光信號的累積對整個PCR進程進行實時監(jiān)測的技術。通過實時監(jiān)測熒光量的變化，獲得待測物質(zhì)達到熒光檢測閾值的循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold，Ct值)[1]。PCR過程中，可以通過熒光信號的強度變化實時監(jiān)測擴增產(chǎn)物量的變化[2]。實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性好、定量準確、快速簡便及高通量等特點，因此在微生物分析、食品科學研究、臨床診斷、腫瘤早期研究等領域的應用十分廣泛。qRT-PCR在微生物生態(tài)學領域中常用于對微生物群落的生理代謝、空間分布及動態(tài)變化等過程的監(jiān)測[3]。在醫(yī)學領域常用于染色體病、基因病的診斷，對腫瘤早期診斷、分型與分期的判斷，以及對病原體DNA的定性及定量檢測方面的研究[4]。在食品科學領域常用于對食品中可能含有的有害細菌進行定量檢測分析，針對轉(zhuǎn)基因食品安全問題建立轉(zhuǎn)基因食品檢測方法[5-6]。近年來，隨著分子生物學技術以及合成生物學領域的相關發(fā)展，其在藥用植物基因表達與藥用植物品種鑒別中的應用也越來越廣泛。

1 藥用植物基因表達分析

實時熒光定量PCR是基因分析表達的一種有效方法，能夠檢測目標基因在mRNA水平上的表達差異，以內(nèi)參基因作為標準的相對定量是目前最常用的DNA定量方法，內(nèi)參基因能夠校正目的基因的相對表達量，確保PCR定量結(jié)果的準確性，對于目的基因表達的差異分析是理清藥用植物中活性物質(zhì)合成途徑的先決條件，因此篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因能夠為目的基因表達差異的進一步分析奠定基礎。近幾年在中藥領域，qRT-PCR技術在藥用植物基因表達分析中得到廣泛應用，目前在何首烏、北柴胡、連翹、茅蒼術、沙氏鹿茸草、遠志和越南參變種(野三七)等藥用植物中研究報道較多[7-19]。

1.1 藥用植物內(nèi)參基因的篩選 將在藥用植物各組織和細胞中表達均相對恒定的內(nèi)參基因作為內(nèi)部參照，能夠校正基因研究過程中存在的系統(tǒng)誤差，確保實驗結(jié)果定量準確。王麗平等[20]利用qRT-PCR技術分析候選基因的組織特異性表達，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過geNorm和NormFinder軟件處理，從千里光15個候選基因中篩選出表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因ACT1，為后續(xù)千里光中的重要基因表達及其作用機制的研究奠定基礎。荊禮等[21]利用geNorm等相關軟件及qRT-PCR技術對林下參在不同生長年限下的內(nèi)參基因進行篩選，篩選出在各年限下表達均穩(wěn)定的內(nèi)參基因翻譯延伸因子α和V-ATP，為后續(xù)林下參的分子生物學研究提供參考。吳亞運等[22]以β-微管蛋白基因作為內(nèi)參基因，通過檢測不同生長時期的茯苓，建立茯苓的定量擴增體系，并對該體系的模板與引物濃度、引物特異性與擴增效率進行優(yōu)化，為進一步探索茯苓代謝產(chǎn)物合成途徑奠定基礎。于曉松等[23]對鉤藤在不同組織、不同遮光時間和不同乙烯處理時間下β-肌動蛋白、翻譯延伸因子和泛素連接酶等8個通用內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行分析，篩選出適用于不同條件的內(nèi)參基因。結(jié)果表明，在不同組織中穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因為翻譯延伸因子-1，在不同時長遮光處理后穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因為gapdh，在不同時長乙烯處理后穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因為泛素連接酶和β-肌動蛋白，綜合實驗結(jié)果分析，在多種表達研究時穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因為泛素連接酶。通過不同環(huán)境與不同處理因素對內(nèi)參基因的篩選，此研究結(jié)果為后續(xù)鉤藤藥用成分基因表達分析的進一步研究提供參考依據(jù)。劉霞宇等[24-25]對忍冬不同器官及其葉片在不同溫度條件下的內(nèi)參候選基因進行綜合分析篩選，優(yōu)選出忍冬綜合通用的內(nèi)參基因，并綜合實驗結(jié)果分析推薦出在不同組織、不同溫度脅迫等條件下具有穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因組合；結(jié)果顯示，不同溫度脅迫條件下表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Lonja.48053，在營養(yǎng)器官的不同生育期中表達最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Lonja.23932，在花器官的不同生育期中表達最為穩(wěn)定內(nèi)參基因為Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，忍冬所有材料中在不同時期、不同處理條件下表達均穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Lonja.36369，該研究提高了忍冬植物在qRT-PCR結(jié)果中的準確性，在分子機制研究方面為忍冬基因表達差異分析奠定基礎。因此篩選在各組織中表達穩(wěn)定性均較好的內(nèi)參基因，是后續(xù)分析功能基因表達差異的基礎，也是獲得真實準確的實驗數(shù)據(jù)的前提[26]。

1.2 目的基因表達差異性分析 目的基因是指在實驗中研究或操控的特定基因，它通常起編碼產(chǎn)物或控制性狀的作用。如植物次生代謝產(chǎn)物生物合成過程中起重要調(diào)控作用的酶就是由目的基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯等過程生成的，對于目的基因表達差異的分析能夠為探究植物次生代謝的調(diào)控功能、藥用植物特異性產(chǎn)物生物合成途徑以及后續(xù)的開發(fā)利用奠定基礎[27]。

目前在對目的基因的研究過程中，許多學者一般是先對其內(nèi)參基因進行篩選，進而對目的基因表達量的差異性進行分析。楊林林等[28]利用qRT-PCR技術及BestKeeper、Delta CT、NormFinder等軟件對狹葉柴胡不同組織中常用的內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性、重復性及準確性評價。利用篩選出的內(nèi)參基因β-微管蛋白對狹葉柴胡中皂苷生物合成關鍵酶基因的表達量進行檢測。該基因在不同組織中存在不同的表達模式，對柴胡皂苷的合成與累積起調(diào)控作用。據(jù)報道，東方澤瀉的主要成分為三萜類化合物，該類化合物生物合成途徑的關鍵酶為鯊烯合酶[29]。劉青芝等[30]應用qRT-PCR技術及Delta CT等軟件對東方澤瀉中候選基因的表達穩(wěn)定性進行分析，在不同激素處理條件下篩選出表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因翻譯延伸因子-1α、泛素連接酶和18S rRNA；并利用內(nèi)參基因分析鯊烯合酶基因表達的特性。結(jié)果顯示，目的基因鯊烯合酶基因在東方澤瀉塊莖中的表達量最高，在根中的表達量最低，這表明該基因的表達具有組織特異性，在東方澤瀉的生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。Yang等[31]對蛇足石杉在不同組織和發(fā)育階段的基因表達情況進行分析，根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)篩選出8個候選基因，用qRT-PCR技術以及NormFinder、BestKeeper、RefFinder等軟件綜合分析候選基因的穩(wěn)定性，篩選出最穩(wěn)定的2個內(nèi)參基因TBP(TATA結(jié)合蛋白)和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)。并利用參與石杉堿甲生物合成的L/ODC、細胞色素P450s基因的表達，對所選候選參考基因進行驗證。結(jié)果表明，TBP基因的表達水平很低，只能在不同情況下作適當驗證，GAPDH可作為在不同組織中單獨用于qRT-PCR標準化的參考基因。葉友杰等[32]對巴戟天不同組織與不同處理的葉中1-脫氧木酮糖-5磷酸合成酶和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因的表達差異性進行分析，并利用篩選出的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻南鄬Ρ磉_量進行校正，結(jié)果顯示巴戟天葉中目的基因1-脫氧木酮糖-5磷酸合成酶和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的相對表達量最高，且不同處理葉中的相對表達量略高于未處理的葉，該實驗結(jié)果為后續(xù)巴戟天中特異性產(chǎn)物合成途徑的研究提供參考。

在某些藥用植物中，內(nèi)生真菌不僅可以通過自身刺激宿主次級代謝物質(zhì)累積，對宿主植物特定功能基因的表達起誘導調(diào)控作用，還可以自身產(chǎn)生與宿主相同或相似的刺激代謝產(chǎn)物，為后續(xù)活性先導化合物的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供可能[33]。如大花紅景天中活性內(nèi)生真菌ZPRa-R-1對紅景天苷的合成累積起促進作用，內(nèi)生真菌Phialocephala fortinii則在大花紅景天基因及代謝途徑差異基因的表達過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。王夢亮等[34-35]通過對大花紅景天幼苗接種ZPRa-R-1，利用qRT-PCR技術及geNorm等軟件分析篩選出2個內(nèi)參基因PCS(植物螯合素合酶)和GAPDH。以內(nèi)生真菌ZPRa-R-1與大花紅景天的相互作用為基礎，利用雙內(nèi)參基因組合作為實驗誤差矯正參數(shù)，對紅景天苷生物合成途徑中4個關鍵酶UDPGT(尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)、TyDC(酪氨酸脫羧酶)和TAT(酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶)基因表達量的差異性進行分析，以不接種真菌的大花紅景天作為對照，結(jié)果顯示處理組中UDPGT基因的相對表達量于第8天達到峰值，后續(xù)呈下降趨勢；PAL基因的相對表達量于第10天達到峰值，且呈現(xiàn)先升后降的趨勢；TyDC基因的相對表達量呈先升后降的趨勢，在第12天達到峰值，后逐漸下降至對照組以下；與對照組相比，處理組中TAT基因的表達量沒有顯著差異。在真菌接種于紅景天之后，測得紅景天苷的含量于第10天顯著升高并達到最大值，后呈現(xiàn)下降的趨勢，基本與目的基因的表達量趨勢相一致，結(jié)果表明，ZPRa-R-1對UDPGT、PAL和TyDC基因表達量具有一定促進作用，同時也促進了次生代謝產(chǎn)物紅景天苷在植物體內(nèi)的累積，該實驗結(jié)果為探究紅景天苷生物合成關鍵酶基因的表達差異規(guī)律及生物合成途徑提供了參考。

另外，王夢亮等[34-35]還基于內(nèi)生真菌Phialocephala fortinii與大花紅景天的相互影響，利用RNA轉(zhuǎn)錄組測序技術篩選出脂代謝、信號轉(zhuǎn)導和環(huán)境適應這3條代謝途徑中影響較大的PISD(磷脂酰絲氨酸脫羧酶)基因、含SNW結(jié)構(gòu)域蛋白1基因(SNW1/SKIP)和病程相關蛋白1基因(PR1)等9個基因，并對以上基因的相對表達量進行分析，揭露Phialocephala fortinii對以上代謝途徑中相關基因表達量的影響過程。結(jié)果顯示，處理組中參與脂代謝途徑基因的相對表達量與對照組基因的相對表達量相比均明顯升高，其中參與甘油磷脂代謝途徑基因PISD的相對表達量提高顯著，在Notch信號通路中基因SNW1/SKIP與在植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑中基因R1和PR2的相對表達量均顯著提高；在環(huán)境適應中基因PR1、基因PR2相對表達量明顯提高，結(jié)果表明內(nèi)生真菌在宿主大花紅景天中對脂代謝途徑基因的表達起促進作用，有效提高了大花紅景天的環(huán)境適應能力，為研究其他真菌與植物的相互作用發(fā)育和代謝機制過程提供參考。

基因能夠決定生物體的特性，為了解藥用植物中具有藥理作用的特異性產(chǎn)物的合成機制，須深入研究基因表達的時空性與差異性等特性。只有充分了解藥用植物基因表達過程中的規(guī)律，才能推動中藥材特異性產(chǎn)物在合成生物學領域的進一步發(fā)展。

1.3 目標成分與基因表達的分析 目前，中藥質(zhì)量控制中常用的定量分析方法有毛細管電泳、氣相色譜、高效液相色譜、液-質(zhì)聯(lián)用及氣-質(zhì)聯(lián)用等方法，這些檢測方法雖能夠檢測出中藥中特征性成分的含量，但無法對其主要特征性成分進行調(diào)控與甄別[36]。如酸棗仁及其偽品滇棗仁中都含有酸棗仁皂苷，因此采用常規(guī)的檢測方法無法判斷中成藥中投放的原料藥材[37-38]，故利用靈敏度高、操作簡便的熒光定量PCR技術對中藥中參與目標成分合成的相關基因進行定量分析，與目標成分定量分析方法相關聯(lián)，可以探究相關合成基因?qū)δ繕顺煞值恼{(diào)控機制，為目標成分的來源給出相對合理的分析。

張杰等[39]采用轉(zhuǎn)錄組熱圖方法對植物中轉(zhuǎn)錄因子基因家族ERF的基因表達從空間和時間2個層面進行分析，根據(jù)可能參與人參皂苷調(diào)控這一因素篩選出表達較高、表達組織特異性較強的6個ERF基因(ERF1B、ERF003、ERF012、ERF026、ERF034、ERF118)。利用UPLC-MS/MS(超高效液相色譜法-串級質(zhì)譜法)對用不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)處理的人參不定根中人參皂苷Rb1、Re、Rg1的含量進行檢測，并使用qRT-PCR技術對MeJA處理過的人參不定根中人參皂苷合成關鍵基因DDS、CYP716A47、CYP716A53v2與ERF的表達進行測定。結(jié)果顯示，在各處理組中DDS、CYP716A47的表達量均顯著提高，其中CYP716A47的表達量隨MeJA處理濃度的增加而提高，在MeJA處理后CYP716A53v2的表達量卻明顯下降，與原人參二醇型人參皂苷Rb1含量上升及原人參三醇型人參皂苷Re、Rg1含量下降相一致；對ERF基因的表達差異情況與DDS、CYP716A47、CYP716A53v2基因的表達特異性進行關聯(lián)分析，推斷出ERF003、ERF012、ERF118與CYP716A53v2存在正調(diào)控，與DDS存在負調(diào)控，可以表明ERF003、ERF012、ERF118可能通過促進CYP716A53v2表達及抑制DDS表達對人參皂苷的合成參與調(diào)控；ERF1B與CYP716A47存在負調(diào)控，可以表明ERF1B可能通過抑制CYP716A47表達對人參皂苷的合成參與調(diào)控。因此根據(jù)ERF家族中基因調(diào)控機制的不同，在生產(chǎn)中應該有針對性地提高正調(diào)控基因的表達量，從而提高人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化率以供應醫(yī)藥市場對人參皂苷的需求量。

He等[40]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對新塔花不同組織中的黃酮類化合物進行檢測，并通過實時定量PCR技術和系統(tǒng)發(fā)育關系對其中黃酮類化合物的生物合成途徑進行分析。結(jié)果顯示，在檢測出的12種主要黃酮類成分中，蒙花苷含量最高，且其含量在新塔花地上部分高于全草?；虮磉_和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，ZbPALs、ZbCHS1、ZbCHI1和Zb4CL3參與了主要黃酮類化合物中間體的生物合成過程，ZbFLS、ZbFNSII和ZbANS分別參與黃酮醇、黃酮和花青素的生物合成過程。

Kohnen等[41]采用定性MALDI-MSI(基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像)、HPLC-MS(高效液相色譜-質(zhì)譜)聯(lián)用技術，對發(fā)育過程中茄科植物澳洲茄不同器官中的生物堿濱草堿、莨菪堿、6-羥基莨菪堿和東莨菪堿進行了定位和定量分析，采用qRT-PCR對參與東莨菪堿生物合成過程的腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(pmt)、托品酮還原酶-1(tr-l)、濱草堿變位酶(cyp80f1)和莨菪堿-6β-羥化酶(h6h)基因表達量進行定量分析。將幾種莨菪烷類生物堿的空間分布結(jié)果與其數(shù)量和模式以及澳洲茄發(fā)育過程中的基因表達分析結(jié)果相結(jié)合，得出生物堿從合成部位根組織、負責運輸?shù)钠鞴偾o組織到儲存器官葉子隨時間變化的流動和累積過程，并繪制出完整的組織結(jié)構(gòu)圖。結(jié)果顯示，在植物發(fā)育的各階段，濱草堿只存在于根組織中，莨菪堿、6-羥基莨菪堿和東莨菪堿則存在于根、莖、葉各組織內(nèi)。其中莨菪堿在根中含量最高，且隨時間變化呈先降后升的趨勢，在莖和葉組織中的含量處于較低水平；莖組織中6-羥基莨菪堿含量最高，其次是東莨菪堿，莨菪堿含量最低，三者在植物發(fā)育期間的比例不變；東莨菪堿在葉中的含量最高，且隨時間變化顯著升高。在植物生長過程中，pmt、tr-l和cyp80f1的轉(zhuǎn)錄水平在根中最高，并且pmt和tr-l的轉(zhuǎn)錄水平隨時間呈先升后降的趨勢，在12周齡植株中的表達水平達到峰值；cyp80f1的轉(zhuǎn)錄水平隨時間變化一直呈上升趨勢。h6h的轉(zhuǎn)錄水平在葉片中最高，且呈先升后降的趨勢，在12周齡植株中的表達水平達到峰值。結(jié)果表明，莨菪堿、6-羥基莨菪堿和東莨菪堿可能作為轉(zhuǎn)運形式存在于負責運輸?shù)那o組織中，在葉片中東莨菪堿則隨著時間的變化而累積，實驗為進一步探究澳洲茄發(fā)育過程中莨菪烷類生物堿的累積結(jié)果以及生物合成的詳細過程奠定基礎?；虮磉_對藥用植物生長過程及活性物質(zhì)在植物體內(nèi)合成過程的影響顯著，從根源出發(fā)對基因表達差異進行分析，并與活性物質(zhì)的生物合成過程相關聯(lián)，最終用于探究活性物質(zhì)與相關基因的聯(lián)系機制，為后續(xù)提高中藥活性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化率，對藥用植物中主要活性物質(zhì)干預調(diào)控與甄別奠定基礎。

2 目的基因的鑒別

中藥質(zhì)量控制包括定性鑒定和定量分析，在分子定量實驗過程中可利用特異性引物擴增不同樣品，從而得到不同PCR產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物的熔解曲線來鑒定中藥材的真?zhèn)渭爸兴幹苿┑膿絺吻闆r。Pan等[42]通過設計真鹿角、哺乳動物特異性引物和TaqMan探針，并利用TaqMan實時定量PCR技術建立鑒別真?zhèn)温菇堑姆椒?，并對該引物與探針的特異性、線性及靈敏度進行檢測。TaqMan探針在“鹿角”和“哺乳動物”DNA片段中雜交，用于監(jiān)測目標基因的擴增過程。利用該方法對10批采購樣品進行分析，結(jié)果顯示該引物成功擴增出真鹿角DNA片段226bp、哺乳動物DNA片段146 bp，快速準確、一步到位地鑒別出真假鹿角。Hua等[43]應用Illumina-RNA-seq技術構(gòu)建太子參cDNA文庫，對太子參的89 857個單基因，在各蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NT、NR、Swiss-Prot、COG、KEGG、Gene Ontology、Interpro)上進行BLASTx和BLASTn相似性搜索，并對所有裝配單基因進行注釋。根據(jù)不同產(chǎn)地太子參的代謝途徑和表達譜，篩選出29個差異顯著的單基因。利用qRT-PCR對這29個差異表達基因進行確認和分析以驗證組裝和注釋結(jié)果。結(jié)果顯示，這些基因主要參與碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝、氨基酸代謝，以及其他次生代謝產(chǎn)物的合成過程。其中，傳統(tǒng)產(chǎn)地太子參的各代謝過程及次生代謝產(chǎn)物的生物合成過程均顯著強于栽培地的中藥。

金龍膠囊主要成分為鮮守宮、鮮蘄蛇和鮮金錢白花蛇，其具有防治艾滋病、抑制腫瘤細胞等藥理作用[44-46]。李曉蕾[47]以金龍膠囊作為研究對象分別對守宮、金錢白花蛇和蘄蛇建立了熒光定量PCR鑒別方法。對金錢白花蛇設計特異性引物COI37/COI337，金錢白花蛇與其偽品的熒光定量PCR鑒別結(jié)果圖顯示僅有金錢白花蛇樣品能夠生成擴增曲線和熔解曲線，說明特異性引物COI37/COI337僅對金錢白花蛇的DNA擴增；對守宮設計特異性引物對GZG1/GZG2，鑒別結(jié)果圖顯示僅有守宮樣品生成擴增曲線和熔解曲線；對蘄蛇設計特異性引物DK1/DK2，鑒別結(jié)果圖顯示僅有蘄蛇樣品生成擴增曲線和熔解曲線。后續(xù)對以上鑒別方法的線性、重復性進行驗證，成功建立的鑒別體系為中成藥的質(zhì)控領域提供了新思路。葉浩婷等[48]對金龍膠囊中鮮守宮投料量建立檢測方法，并對該檢測方法的特異性、靈敏度和線性進行驗證。結(jié)果顯示，樣品拷貝數(shù)的濃度比例與鮮守宮全正品、正偽品1∶1、正偽品1∶4的投料比例基本相一致。說明所建立的鮮守宮定量分析方法能有效地應用于守宮及其偽品的鑒別。利用多重連接探針擴增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA)技術建立常見蛇類藥材金錢白花蛇分子鑒定方法，對金錢白花蛇及其常見偽品赤練華游蛇、黃斑漁游蛇、尖吻蝮蛇和眼鏡蛇能同時進行鑒別、區(qū)分和相對定量分析。其基于通用引物擴增的COI序列，設計了5個物種的特異性MLPA探針，該探針具有較高的特異性和靈敏度。分析表明，MLPA法可檢出混合樣品中5%的金錢白花蛇或8.75%的偽品，特別是根據(jù)MLPA峰面積值可推斷出雜質(zhì)的相對含量[49-50]。傳統(tǒng)物理和化學鑒別方法具有局限性，對經(jīng)過切片，打粉等加工制作的中藥材或?qū)σ呀?jīng)制劑成型的中成藥則無法準確進行真?zhèn)舞b定，而利用qRT-PCR建立的鑒定分析方法的實用性則更加廣泛，該方法具有較好的靈敏度，對于摻偽比例較高的樣品能夠進行準確鑒定，未來可能在中藥市場鑒定方面的應用會更加廣泛。

3 小結(jié)

目前，在分析藥用植物基因信息與活性成分生物合成途徑和調(diào)控機制方面已取得進展[51]。藥用植物在生長、發(fā)育及成熟過程中，其基因的表達在不同時期存在很大的差異。了解藥用植物生長發(fā)育過程及其特異性代謝物的生物合成過程，必須要對基因表達量的差異進行分析，利用基因的差異分析進行中藥真?zhèn)舞b定、道地藥材的選定以及各地區(qū)同種藥材差異的鑒定，已成為中藥質(zhì)量鑒定發(fā)展的新方向之一。qRT-PCR作為基因差異表達分析及中藥真?zhèn)舞b定中的重要技術，具有高特異性、高靈敏度、線性好、快速簡便且儀器自動化水平高等眾多優(yōu)點[52-53]。

4 討論

qRT-PCR方法已廣泛應用于藥用植物基因差異表達分析[54-56]，在某些方面也存在一些不足之處值得進一步優(yōu)化與改進，主要有以下幾個方面：1)檢測所需試劑的選擇范圍較小，PCR buffer等相關試劑具有一定的毒性，在當前提倡綠色發(fā)展的理念下，還有待提升；2)差異分析時對內(nèi)參基因選擇中有時存在一定的不準確性，可能導致在基因差異的定量研究過程中產(chǎn)生實驗誤差；3)樣品制備過程中，某些標準的不統(tǒng)一會影響樣本初始濃度而產(chǎn)生差異，降低定量檢測結(jié)果的準確性；4)實驗中所用熒光染料價格較高，一定程度上阻礙該技術的普遍應用。針對以上問題，建議以降低毒性或污染為目標開發(fā)新的實驗試劑或優(yōu)化現(xiàn)有的試劑，提高熒光染料的研制技術以縮短生產(chǎn)時長，增強熒光染料的穩(wěn)定性以方便儲存，進而可提高熒光染料的生產(chǎn)量，逐步降低市場價格，從而擴大qRT-PCR的應用范圍。針對所選內(nèi)參基因不準確這一問題，建議逐步建立內(nèi)參基因庫，為規(guī)范藥用植物基因表達差異的研究提供準確參考；此外實驗中規(guī)范樣本制備步驟及儲存要求，從根源上提高定量檢測方法的準確性。

利用分子定量技術與內(nèi)參基因分析軟件篩選出各藥用植物的內(nèi)參基因，是藥用植物功能基因的差異分析與特異性活性成分的生物合成過程分析的基礎。通過對特異性產(chǎn)物在藥用植物體內(nèi)合成過程的探索，建立成熟的體外生物合成途徑，不僅能縮短活性成分的產(chǎn)出時間，增加活性成分的產(chǎn)量，降低中藥藥品的原料成本，還能促進中藥產(chǎn)業(yè)工業(yè)化發(fā)展進程。qRT-PCR作為誤差相對較小的起始定量方法，還可結(jié)合生物芯片等先進基因技術，實現(xiàn)qRT-PCR與相關基因定量技術的聯(lián)用，以建立更為精準的分子定量方法體系，未來在藥用植物藥效成分基因篩選、精準化基因定量等研究方面的應用會更加廣泛。