不同提取和測(cè)定方法對(duì)蟾酥蛋白提取率和含量的影響

王 鵬， 張 雯， 周 迪， 張劉強(qiáng)， 吳迎春， 郭夫江*， 李醫(yī)明*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤一科，上海 200437)

蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider的干燥分泌物[1]，作為一味重要的傳統(tǒng)中藥，其化學(xué)成分復(fù)雜，臨床用途較廣，具有解毒、止痛、開(kāi)竅醒神功效，在麝香保心丸、六神丸等中起著重要的作用。隨著對(duì)蟾酥研究的逐步深入，其小分子化學(xué)成分及藥理活性機(jī)制日益清晰，主要用于抗腫瘤、強(qiáng)心、抗菌、鎮(zhèn)痛等方面[2-5]，甚至局部麻醉，而且療效顯著。

生物大分子藥物由于具有高活性、強(qiáng)特異性、低毒性和生物功能明確等特點(diǎn)而受到重視，但對(duì)動(dòng)物類(lèi)中藥中蛋白類(lèi)大分子成分的研究較少。近年來(lái)，人們對(duì)天然來(lái)源大分子，例如核酸、蛋白質(zhì)的替代藥物越來(lái)越感興趣[6]，它們與中藥中的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物共同發(fā)揮有效作用。研究天然產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能時(shí)，首先要得到高純度的蛋白，故高效的提取分離方法是基礎(chǔ)。

以往對(duì)蟾酥的研究集中在蟾酥甾烯等小分子成分上[7]，而對(duì)其大分子成分關(guān)注較少。本實(shí)驗(yàn)分別采用堿提醇沉法、Tris-NaCl溶液法、PBS溶液法、丙酮沉淀法提取蟾酥鮮漿中蛋白，并通過(guò)優(yōu)化提取溶液的pH值來(lái)改善提取效果，提高蛋白提取率。另外，蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定也至關(guān)重要，通常有凱氏定氮法[8]、福林酚法(Lowry法)[9]、雙縮脲法[10]、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)[11]、2，2′-聯(lián)喹啉-4，4’-二羧酸法(BCA法)[12]、紫外-可見(jiàn)分光光度法[13]等，本實(shí)驗(yàn)分別采用Bradford法、BCA法測(cè)定蟾酥蛋白含量，旨在為該類(lèi)成分含量測(cè)定提供參考。

1 材料

1.1 藥材與試劑 蟾酥鮮漿(用于蛋白提取和含量研究，上海金蟾健康科技有限公司，批號(hào)20170419；用于不同來(lái)源藥材蛋白含量比較，產(chǎn)地漢中、山東、浙西、江西、安皖、臨沂小、臨沂大、皖北、上海、河南)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)。NaOH、Tris、氯化鈉、乙醇、丙酮、PBS溶液均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器 5810R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Ultracel?-3K超濾管(德國(guó)Merck Millipore公司)；Paradigm?酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；96孔板(美國(guó)Corning公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 蟾酥蛋白提取

2.1.1 堿提醇沉法 取-80 ℃冷凍蟾酥鮮漿5 g，各3份，分別置于3個(gè)燒杯中，室溫解凍1 h。為考察提取液堿性強(qiáng)弱對(duì)蛋白提取率的影響，在加入100 mL去離子水后用1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)3份提取液pH至7.8、9.0、10.2，加去離子水至最終體積為200 mL，燒杯中加入攪拌子，室溫提取5 h，靜置，將上清液轉(zhuǎn)移至若干個(gè)50 mL離心管中，3 900 r/min離心1 h，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，合并濾液，加入200 mL冰乙醇[14](-20 ℃放置2 h)，離心收集沉淀，200 mL溶液(含25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH7.8)復(fù)溶。

2.1.2 Tris-NaCl溶液法 取-80 ℃冷凍蟾酥鮮漿5 g，各3份，分別置于3個(gè)燒杯中，室溫解凍1 h。為考察Tris-NaCl提取液酸堿性對(duì)蛋白提取率的影響，分別于3個(gè)燒杯中加入Tris-NaCl(含25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl，pH5.4)溶液、Tris-NaCl(含25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl，pH7.8)[15]溶液、Tris-NaCl(含25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl，pH10.2)溶液至最終體積為200 mL。燒杯中加入攪拌子，室溫提取5 h，靜置，將上清液轉(zhuǎn)移至若干50 mL離心管中，3 900 r/min離心1 h，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，合并濾液。

2.1.3 PBS溶液法 取-80 ℃冷凍蟾酥鮮漿5 g，置于燒杯中，室溫解凍1 h。由于100 mmol/L PBS(pH7.0)溶液前期被優(yōu)選用于蛋白提取[16]，故在燒杯中加入該溶液至最終體積為200 mL，燒杯中加入攪拌子，室溫提取5 h，靜置，將上清液轉(zhuǎn)移至若干個(gè)50 mL離心管中，3 900 r/min離心1 h，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，合并濾液。

2.1.4 丙酮沉淀法 取-80 ℃冷凍蟾酥鮮漿5 g，置于燒杯中，室溫解凍1 h，加入磷酸緩沖溶液(20 mmol/L，pH8.0)至最終體積為200 mL，燒杯中加入攪拌子，室溫提取5 h，靜置，上清液轉(zhuǎn)移至若干個(gè)50 mL離心管中，3 900 r/min離心1 h，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，合并濾液，加入200 mL冰丙酮[17-18](-30 ℃放置2 h)，離心收集沉淀，200 mL溶液(含25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH7.8)復(fù)溶。

2.2 超濾去除小分子 在4 ℃、3 900 r/min條件下用超濾管[19]離心濃縮蟾酥提取物溶液，使蛋白與小分子分離，將濾液棄去，合并濃縮液，用相應(yīng)條件下提取液溶解濃縮物后繼續(xù)超濾，重復(fù)5次，最后將濃縮物用相應(yīng)的提取液或復(fù)溶溶液溶解并定容至100 mL，在-80 ℃下保存。

2.3 蛋白含量測(cè)定

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)加樣(BCA法)

表2 蟾酥蛋白含量測(cè)定結(jié)果(BCA法)

2.3.2 Bradford法 BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(2.0 mg/mL)用0.9% NaCl溶液稀釋至1 000 μg/mL，按表3方法進(jìn)行稀釋?zhuān)渲艬SA標(biāo)準(zhǔn)品(0號(hào)管為空白對(duì)照)。將10 μL標(biāo)準(zhǔn)品及不同提取方法得到的樣品稀釋50倍，置于96微孔板孔中，每孔加入250 μL考馬斯亮藍(lán)試劑，微孔板振蕩器混合30 s，取出微孔板，室溫孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.001 2X+0.350 8(r=0.997 5)，計(jì)算蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)加樣(Bradford法)

表4 蟾酥蛋白含量測(cè)定結(jié)果(Bradford法)

再比較堿提醇沉法、Tris-NaCl溶液法、PBS溶液法、丙酮沉淀法對(duì)蟾酥蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，堿提醇沉法提取率較低，pH值對(duì)其影響不大；Tris-NaCl溶液法提取率較高，在pH為7.8時(shí)更明顯；PBS溶液法、堿提醇沉法提取率相差不大，丙酮沉淀法提取率最低；采用BCA法、Bradford法測(cè)定蟾酥蛋白含量時(shí)，所得結(jié)果大致相同。

2.3.3 對(duì)比試驗(yàn) 分別采用BCA法、Bradford法測(cè)定Tris-NaCl溶液法(pH7.8)所提取蟾酥蛋白含量各6次，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，2種方法重復(fù)性均良好；F=1.86，F(xiàn)

表5 BCA法、Bradford法測(cè)定蟾酥蛋白含量比較(n=6)

2.3.4 不同來(lái)源蟾酥鮮漿中蛋白含量 采用Tris-NaCl溶液法(pH7.8)提取10個(gè)產(chǎn)地蟾酥鮮漿蛋白，測(cè)定其提取率，結(jié)果見(jiàn)表6。由此可知，提取率均在20%左右，表明該提取方法穩(wěn)定可靠。

表6 不同產(chǎn)地蟾酥鮮漿蛋白提取率測(cè)定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同提取方法下蟾酥中蛋白提取率有差異，其中丙酮沉淀法最低，Tris-NaCl溶液法(pH7.8)最高，提取率為24.7%，并且該方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)活性蛋白質(zhì)破壞作用極小，適用于不同產(chǎn)地的樣品基質(zhì)，并且提取后的蛋白溶液可以根據(jù)臨床應(yīng)用、生產(chǎn)的特殊要求進(jìn)行緩沖液置換，滿(mǎn)足臨床應(yīng)用和生產(chǎn)的需求。常用蛋白含量的測(cè)定方法都存在一定局限性，例如凱氏定氮法靈敏度較低，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)；Lowry法因干擾物質(zhì)較多，所得結(jié)果通常不準(zhǔn)確；雙縮脲法、紫外分光光度法雖然簡(jiǎn)便快速，但前者靈敏度低，后者僅適用于純化蛋白質(zhì)的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)分別采用BCA法、Bradford法測(cè)定蟾酥蛋白含量，兩者靈敏度高，操作快速簡(jiǎn)便，并且前者所用試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性良好，干擾物質(zhì)較少，而后者還具有成本低的優(yōu)勢(shì)，結(jié)果表明，這2種方法重復(fù)性理想，精密度高，所得數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異，均可作為蟾酥蛋白含量的測(cè)定方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)可為蟾酥蛋白提取工藝和含量檢測(cè)方法研究提供參考，也能為其蛋白純化和活性功能考察提供依據(jù)。