蟾酥貯藏期間化學(xué)成分的變化

劉京京宋嬿 卞雪蓮李冬 郭夫江 吳迎春? 李醫(yī)明?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 上海201203； 2.上海上藥華宇藥業(yè)有限公司， 上海200082； 3.上海金蟾健康科技有限公司， 上海201906）

蟾酥為傳統(tǒng)名貴中藥，來(lái)源于蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Bufo melanostictusSchneider 的干燥分泌物，其具有很高的醫(yī)療價(jià)值［1］。蟾酥是麝香保心丸和六神丸等中成藥的主要原料，每年的市場(chǎng)需求量非常大，且價(jià)格逐年增長(zhǎng)，因此在蟾酥的流通和貯藏環(huán)節(jié)確保其質(zhì)量穩(wěn)定非常重要［2?4］。2020 年版《中國(guó)藥典》對(duì)蟾酥性狀的規(guī)定是“呈扁圓形團(tuán)塊狀或片狀，棕褐色或紅棕色，團(tuán)塊狀者質(zhì)堅(jiān)，不易折斷，斷面棕褐色，角質(zhì)狀，微有光澤；片狀者質(zhì)脆，易碎，斷面紅棕色，半透明”［5］。蟾酥中主要活性成分為蟾毒配基類(lèi)化合物，其含量是評(píng)價(jià)蟾酥質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要標(biāo)準(zhǔn)［6］，藥典中規(guī)定蟾酥指標(biāo)成分蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基三者之和不低于7.0%。

很多中藥飲片廠反應(yīng)蟾酥在貯藏的過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)指標(biāo)成分含量出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，因此考察不同貯藏條件對(duì)蟾酥化學(xué)成分的變化影響，形成合適的蟾酥貯藏環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，可減少中藥飲片類(lèi)企業(yè)因貯藏不當(dāng)導(dǎo)致蟾酥質(zhì)量下降而造成經(jīng)濟(jì)損失［7?9］。同時(shí)由于蟾酥都是少量多批次收購(gòu)，且每個(gè)批次都需要進(jìn)行檢測(cè)，而檢測(cè)時(shí)都需要用到對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照，這些對(duì)照品購(gòu)買(mǎi)比較昂貴，且需要多次使用，因此如何保存這些對(duì)照品溶液也顯得非常重要?；谝陨显?，有必要對(duì)蟾酥及其標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液在不同貯藏溫度下化學(xué)成分變化情況進(jìn)行考察。本研究將同批蟾毒靈甲醇溶液、華蟾酥毒基甲醇溶液和脂蟾毒配基甲醇溶液，同時(shí)存放在－18、4、25 ℃環(huán)境下，經(jīng)過(guò)連續(xù)20 d 的動(dòng)態(tài)觀察和測(cè)定，記錄了其化學(xué)成分變化情況，并確定變化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；將同批蟾酥藥材存放在－18、4、25 ℃環(huán)境下，經(jīng)過(guò)連續(xù)24 個(gè)月的動(dòng)態(tài)觀察和測(cè)定，為蟾酥貯藏環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent Technologies 1260 Infinity 高效液相色譜儀、1260 Infinity Ⅱ半制備液相（美國(guó)安捷倫公司）；BT125D 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；SK5200H 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；F／KSWB?50L 快速溫變?cè)囼?yàn)箱（上海豐實(shí)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Delta series 生物安全柜（美國(guó)Labconco 公司）；Sephadex LH?20 凝膠（美國(guó)Pharmacia 公司）；Bruker Avance 600 核磁共振儀（德國(guó)布魯克公司）；Q?TOF?Ultima 質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）。

甲醇、乙醇、丙酮為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司）。蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基為蟾酥中分離制備得到，面積歸一化法測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%。蟾酥由上海金蟾健康科技有限公司于2018 年5 月提供，經(jīng)鑒定為正品。

2 方法和結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對(duì)照品25.0 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，精密吸取1 mL，于10 mL 量瓶中定容，搖勻后0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。對(duì)照品蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基溶液質(zhì)量濃度均為0.5 mg／mL。分別貯藏于－18、4、25 ℃環(huán)境中，每隔半個(gè)月進(jìn)行1 次測(cè)定。

2.2 色譜條件 Agilent Extend?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.3 % 乙酸（B），梯度洗脫（0～15 min，28%～54% A；15～35 min，54%A）；柱溫30 ℃；體積流量0.6 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm［10］。

2.3 對(duì)照品溶液含量測(cè)定 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算對(duì)照品溶液的含量。3 個(gè)對(duì)照品中蟾毒靈和脂蟾毒配基溶液在不同的貯藏溫度下20 d 內(nèi)含量保持不變，華蟾酥毒基甲醇溶液在4、25 ℃環(huán)境下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)含量不斷下降，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

圖1 不同溫度下華蟾酥毒基含量隨時(shí)間變化Fig.1 Cinobufagin contents under exposure of different temperatures and time length

2.4 華蟾酥毒基分解產(chǎn)物鑒定 制備10 mg／mL華蟾酥毒基溶液，60 ℃下快速產(chǎn)生分解產(chǎn)物，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備得分解產(chǎn)物，并通過(guò)ESI?MS、1H?NMR 和13C?NMR 測(cè)定其化合物結(jié)構(gòu)。

圖2 華蟾酥毒基HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of cinobufagin

分解產(chǎn)物為白色不定型粉末，ESI?MSm／z：401 ［M＋H］＋，分子式為C24H32O5。1H?NMR（600 MHz，MeOD）δ：8.09（1H，brd，J＝9.3 Hz，H?22），7.40（1H，dd，J＝9.3，1.5 Hz，H?21），6.21（1H，d，J＝1.5 Hz，H?21），4.71（1H，dd，J＝9.2，2.1 Hz，H?16），4.14（1H，m，H?3），3.56（1H，m，H?15），2.69（1H，d，J＝9.2 Hz，H?17），0.96（3H，s，H?19），0.69（3H，s，H?18）；13C?NMR（150 MHz，MeOD）δ：164.7（C?24），152.6（C?21），151.9（C?22），119.8（C?20），113.6（C?23），72.5（C?14），70.6（C?16），69.0（C?3），63.2（C?15），53.0（C?17），44.2（C?13），33.6（C?8），36.8（C?10），41.2（C?5），40.8（C?12），36.7（C?4），25.8（C?6），39.7（C?9），29.5（C?1），34.5（C?2），20.1（C?7），20.2（C?11），22.6（C?19），17.6（C?18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道比對(duì)，鑒定化合物為去乙酰華蟾酥毒基。

2.5 供試品溶液的制備 將蟾酥于2018 年5 月10日置于黑色塑料袋中，分別貯藏于－18、4、25 ℃中，測(cè)定第0 月含量，之后每3 個(gè)月進(jìn)行外觀觀察和含量測(cè)定。

分別精密稱(chēng)取蟾酥細(xì)粉25.0 mg，置于具塞圓底燒瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，置于水浴鍋中，待甲醇微沸后，連續(xù)回流60 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，精密吸取上清液1 mL，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.6 不同貯藏條件蟾酥外觀變化 隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，－18、4 ℃下的蟾酥色澤未見(jiàn)明顯變化，質(zhì)地較硬；25 ℃下的蟾酥貯藏12 個(gè)月后顏色變黑，斷面失去光澤，質(zhì)地變軟。

2.7 蟾酥含量測(cè)定 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定蟾酥中3 種蟾毒配基類(lèi)成分含量（圖3）。由表1可知，－18 ℃貯藏條件下蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量?jī)赡陜?nèi)無(wú)變化。4、25 ℃貯藏條件下蟾酥中蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基總含量逐月下降，4 ℃貯藏12 個(gè)月后總含量低于7%；25 ℃貯藏6 個(gè)月后總含量低于7%。

表1 蟾酥中成分含量隨時(shí)間和溫度變化Tab.1 Contents variations of B.Venenum constituents due to exposure to different temperatures and time length

圖3 不同貯藏時(shí)間各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents due to different shelf time

3 討論

3.1 對(duì)照品在貯藏過(guò)程中的變化 藥典中規(guī)定的蟾酥中3 個(gè)指標(biāo)成分蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基從化合物結(jié)構(gòu)上看都屬于甾體類(lèi)成分，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，而華蟾酥毒基結(jié)構(gòu)中16 位羥基與乙酰基成酯，這一結(jié)構(gòu)在貯藏時(shí)受溫度的影響比較大，容易發(fā)生水解生成去乙酰華蟾酥毒基［12］，從而影響對(duì)照品純度，因此對(duì)于需要經(jīng)常檢測(cè)蟾酥的科研和企業(yè)單位，華蟾酥毒基的對(duì)照品溶液需要保存在－18 ℃中，或者每次使用前需重新配制。

3.2 蟾酥貯藏過(guò)程中性狀和含量變化規(guī)律 本研究選用上海崇明地區(qū)所產(chǎn)的蟾酥鮮漿，制作成蟾酥成品。樣品分別貯藏于－18、4、25 ℃環(huán)境下連續(xù)觀察2年，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，25 ℃環(huán)境下的蟾酥色澤加深，質(zhì)地變軟，外觀上已經(jīng)不符合藥典的要求，而－18、4 ℃環(huán)境下的蟾酥色澤未見(jiàn)明顯變化，質(zhì)地較硬；－18 ℃環(huán)境下蟾酥中蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量基本不變；4、25 ℃環(huán)境下華蟾酥毒基含量明顯下降，在初期3 個(gè)指標(biāo)成分中含量總和為9.7%，而放置6 個(gè)月以上則低于《中國(guó)藥典》規(guī)定的7.0 %，質(zhì)量不合格，其中變化的主要原因是蟾酥中華蟾酥毒基會(huì)發(fā)生脫乙酰酯降解，而蟾毒靈和脂蟾毒配基含量相對(duì)穩(wěn)定。

3.3 對(duì)蟾酥流通環(huán)節(jié)的建議 蟾酥是傳統(tǒng)貴稀中藥材，具有良好的強(qiáng)心、抗腫瘤等生物活性，是生產(chǎn)麝香保心丸、六神丸、蟾酥注射液等中成藥的重要原料。由于中華大蟾蜍和黑框蟾蜍的動(dòng)物資源日益減少，而以蟾酥為原料的中藥制劑需求卻在增加，同時(shí)又因蟾酥來(lái)源分布較廣，很多產(chǎn)地的蟾酥達(dá)不到藥典規(guī)定而被作為不合格產(chǎn)品廢棄，導(dǎo)致蟾酥價(jià)格在逐年增長(zhǎng)，所以蟾酥的加工、貯藏等環(huán)節(jié)就顯得尤為重要，如不能合理地貯藏則可能因發(fā)霉變質(zhì)、含量下降等原因?qū)е庐a(chǎn)品不合格而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建議企業(yè)貯藏蟾酥時(shí)選擇冷凍、避光的環(huán)境。