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    新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2中四氫嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及其功能鑒定

    2022-11-30 07:04:12譚琳NWENiWinHtet陳償PANZhiqiang
    生物技術(shù)進(jìn)展 2022年6期
    關(guān)鍵詞:基因簇天冬氨酸嘧啶

    譚琳,NWE Ni Win Htet,2,陳償,PAN Zhiqiang

    1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院??趯?shí)驗(yàn)站,???71101;

    2.緬甸生物技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室,緬甸 皎施 05151;

    3.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所,熱帶海洋生物資源和生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510301;

    4.美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局天然產(chǎn)物利用研究中心,美國(guó) 牛津 38677-1848

    相容性溶質(zhì)是微生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種對(duì)抗外界不斷變化滲透壓的一類化合物[1]。四氫嘧啶類物質(zhì)是一類廣泛分布在嗜鹽菌和非嗜鹽菌中的相容性溶質(zhì),具有極好的滲透壓保護(hù)功能[2-3]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶不僅是調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞滲透壓的物質(zhì),還是細(xì)胞及大分子物質(zhì)的生物保護(hù)劑。四氫嘧啶可緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學(xué)試劑對(duì)蛋白、核酸、生物膜及整個(gè)細(xì)胞的毒害作用[4-6],且能在人體皮膚保護(hù)[7-9]、抗炎癥治療[10-12]、緩解神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮作用[13],因此在醫(yī)療、酶工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。由于天然微生物中四氫嘧啶含量很低,提取困難,同時(shí)四氫嘧啶僅含有1個(gè)手性碳原子,也難以通過化學(xué)方法合成[14]。目前四氫嘧啶的生產(chǎn)大多通過發(fā)酵具有四氫嘧啶合成能力的中度嗜鹽微生物獲得大量的四氫嘧啶。但此方法的缺點(diǎn)是,高鹽濃度下發(fā)酵對(duì)設(shè)備損耗較大導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高,并且中度嗜鹽微生物不是常用的工業(yè)微生物菌種,生長(zhǎng)慢、發(fā)酵周期長(zhǎng)、最終產(chǎn)率低[15]。為了簡(jiǎn)化這種復(fù)雜的生產(chǎn)工藝,目前將來源于嗜鹽菌中的四氫嘧啶合成基因簇ectABC轉(zhuǎn)入非嗜鹽菌,在非嗜鹽菌中重構(gòu)四氫嘧啶的合成通路。重組菌株在中度鹽離子濃度或者低鹽離子濃度脅迫下合成四氫嘧啶[16]。在本團(tuán)隊(duì)前期研究中,對(duì)一株來自南海珊瑚礁的新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定,通過antiSMASH軟件預(yù)測(cè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇,發(fā)現(xiàn)此細(xì)菌基因組中含有四氫嘧啶合成基因簇[17]。本研究旨在分離新的四氫嘧啶合成基因簇ectABC,并在大腸桿菌BW25113中重構(gòu)四氫嘧啶的合成通路,通過優(yōu)化全細(xì)胞催化條件,為構(gòu)建四氫嘧啶高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑、菌株限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ購(gòu)自Biolabs公司(New England);氨芐青霉素和1kb DNA Ladder購(gòu)于生工生物(上海)有限公司。PrimeSTAR?Max DNA polymerase購(gòu)自TaKaRa公司;四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司;菌株新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所陳償研究員提供;pBAD載體為本實(shí)驗(yàn)室保存;E.coliBW25113感受態(tài)購(gòu)自上海維地生物公司。試驗(yàn)于2020年3月—2021年5月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。

    1.1.2 主要儀器高速冷凍離心機(jī)(Thermo-Fisher,Sorvall legend Micro 21R)、恒溫?fù)u床(智誠(chéng),ZWY-2102)、電泳儀(Wix-EP600)、PCR儀(Ta-KaRa TP600)、凝膠成像系統(tǒng)(AlphaImager 2401)、納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Ekspertnano LC 425/Ultimate 3000/Q-trap 6500+AB sciex 6500+)。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA提取將菌株CJG02-2用

    2216E(海博生物公司)培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)過夜,常溫8 000 r·min-1離心5 min,收集菌體,按照Ta-KaRa微生物基因組DNA提取試劑盒(TaKaRaMini-BEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒Ver.3.0)操作步驟,提取基因組DNA。

    1.2.2 四氫嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)CGJ02-2全基因組測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)克隆ectABC基因簇的1對(duì)引物:EctF:5'-CTAGCTAGCATGATCACATCAGCACCTTGGGT C-3'和EctR:5'-CCGGAATTCTTAGTCAACGAGA GGATAAACACC-3'(下劃線部分別為NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。以菌株CGJ02-2全基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸70 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pBAD均用NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物回收后通過T4 DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài),獲得的重組子用雙酶切鑒定,陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。提取測(cè)序正確克隆中的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主BW25113感受態(tài)細(xì)胞。

    1.2.3 ectABC在大腸桿中的重組表達(dá)及鑒定將帶有重組質(zhì)粒pBAD ectABC的陽性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃過夜。取適量過夜培養(yǎng)物加入LB培養(yǎng)基中(1∶100),37℃培養(yǎng)3 h,使其OD600為0.6。然后將L-阿拉伯糖添加到細(xì)菌培養(yǎng)物中使其終濃度為0.1%,30℃220 r·min-1誘導(dǎo)6 h。收集1 mL細(xì)菌培養(yǎng)液,4℃6 000 r·min-1離心5 min。將細(xì)胞用50μL 1×SDS上樣緩沖液(BOSTER,AR1142)重新懸浮,并在沸水中煮10 min。然后將裂解液在12 000 r·min-1下離心10 min,取10μL上清液,用SDS-PAGE分析重組表達(dá)情況。陰性對(duì)照為未添加L-阿拉伯糖的重組菌株BW25113pBAD-ectABC培養(yǎng)產(chǎn)物和添加L-阿拉伯糖的菌株BW25113pBAD(空載體)培養(yǎng)產(chǎn)物。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果,從凝膠上切取重組表達(dá)蛋白條帶,送上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心,通過納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定其是否為ectA、ectB、ectC。

    1.2.4 重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)四氫嘧啶參照1.2.3中的方法將重組菌株進(jìn)行活化、擴(kuò)大培養(yǎng)及L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá),8 h后,以7 000 r·min-1、4℃離心10 min,收集細(xì)胞,用0.85%NaCl溶液洗滌兩次,然后再懸浮在含有100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)、50 mmol·L-1天冬氨酸鈉、50 mmol·L-1KCl和100 mmol·L-1甘油的反應(yīng)混合物中,形成細(xì)胞懸浮液。使細(xì)胞懸液在30℃、120 r·min-1、24 h下進(jìn)行催化反應(yīng)。全細(xì)胞催化24 h完成后,9 000 r·min-1離心收獲上清,用0.45 mm濾膜過濾后用型號(hào)為BRUKER compact的電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析四氫嘧啶的產(chǎn)生。質(zhì)譜條件:掃描范圍為m/z 50-1300,霧化器壓力1.8 Bar,毛細(xì)管出口電壓500 V,毛細(xì)管電壓4 500 V,正離子化模式的電噴霧電離,碰撞能量7 eV,干燥氣溫度250℃。

    1.2.5 全細(xì)胞催化的優(yōu)化為了獲得最佳的全細(xì)胞催化條件,在全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)中,首先對(duì)底物天冬氨酸濃度(50~300 mmol·L-1)進(jìn)行優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上,分析了不同濃度KCl(0~300 mmol·L-1)轉(zhuǎn)化液中四氫嘧啶的產(chǎn)率。然后在pH 7.0的情況下,比較了不同溫度(25~40℃)對(duì)四氫嘧啶生產(chǎn)的影響。在獲得最適溫度的基礎(chǔ)上,添加最適濃度底物和KCl,使生物轉(zhuǎn)化在pH 6.0~8.0條件下進(jìn)行,獲取最適pH反應(yīng)條件。所有的催化反應(yīng)在細(xì)胞密度OD600=5的條件下進(jìn)行,通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)四氫嘧啶的合成及其產(chǎn)量。HPLC分析檢測(cè)條件為:色譜柱waters XBridge Amide,3.5μm,流動(dòng)相B(乙腈)∶C(水)=75∶25,柱溫30℃,波長(zhǎng)210 nm。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 四氫嘧啶合成基因簇etcABC的克隆及重組表達(dá)載體構(gòu)建

    以菌株CGJ02-2全基因組DNA為模板,EctF和EctR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物大小約為2 235 bp(圖1),與預(yù)期的ectABC基因簇大小一致。目的片段與載體連接、轉(zhuǎn)化后獲得陽性克隆,雙酶切鑒定顯示重組質(zhì)粒中有2 235 bp左右的片段插入(圖2),測(cè)序后顯示四氫嘧啶合成基因簇ectABC的長(zhǎng)度和序列與理論一致。

    圖1 四氫嘧啶合成基因簇etcABC PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR of etcABC gene cluster for ectoine

    圖2 重組質(zhì)粒pBADetcABC的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pBADetcABC by synthesis double restriction enzyme digestion

    2.2 etcABC在大腸桿菌中的重組表達(dá)及鑒定

    重組菌株BW25113pBAD-ectABC,經(jīng)0.1%L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)后,采用SDS-PAGE電泳鑒定細(xì)胞裂解液上清,發(fā)現(xiàn)與含有pBAD空載體的菌株誘導(dǎo)以及含有重組表達(dá)載體pBAD-ectABC菌株未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液上清相比,產(chǎn)生了3個(gè)重組蛋白(圖3)。其大小分別為15、40、13 kD左右,與ectA(20 kD)、ectB(45.9 kD)、ectC(14.8 kD)的理論值存在差異,可能的原因是某些親水性的氨基酸與SDS結(jié)合率低造成了重組蛋白在電場(chǎng)中的泳動(dòng)發(fā)生了偏移[18]。進(jìn)一步應(yīng)用飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定了3個(gè)重組蛋白的分子量和氨基酸序列。結(jié)果顯示其肽段覆蓋率分別達(dá)94%、91%、74%。其相應(yīng)的分子量分別為20.1、45.9和14.8 kD,與ectA、ectB、ectC的分子量理論值一致。

    圖3 SDS-PAGE分析ectA、ectB、ectC的重組表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis for the recombinant expression of ectA,ectB,ectC

    2.3 重組菌株全細(xì)胞生產(chǎn)四氫嘧啶

    利用高分辨質(zhì)譜鑒定重組菌株BW25113 pBAD-ectABC誘導(dǎo)后全細(xì)胞上清中的四氫嘧啶,以重組菌株未誘導(dǎo)全細(xì)胞上清為陰性對(duì)照,四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)的重組菌株全細(xì)胞催化上清中,有一個(gè)化合物的分子量為143.079,分子式為C6H11N2O2。而標(biāo)準(zhǔn)品的分子量為143.080 5,分子式為C6H11N2O2,這表明重組菌株能夠合成四氫嘧啶,并將其分泌到上清中。

    圖4 四氫嘧啶的高分辨質(zhì)譜鑒定Fig.4 Identification of ectoine by high resolution mass spectrometry

    2.4 天冬氨酸鈉濃度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

    作為四氫嘧啶合成的底物,天冬氨酸的濃度是影響四氫嘧啶產(chǎn)量的重要因素。因此,首先研究了不同濃度天冬氨酸鈉對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。如圖5所示,隨著天冬氨酸鈉濃度的升高,四氫嘧啶產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)天冬氨酸鈉濃度達(dá)100 mmol·L-1時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量最高,為0.86 mg·mL-1,與其他各濃度下生成的四氫嘧啶產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)。當(dāng)天冬氨酸鈉濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量逐步下降,當(dāng)天冬氨酸鈉濃度為300 mmol·L-1時(shí),四氫嘧啶的產(chǎn)率僅為0.52 mg·mL-1。因此,天冬氨酸鈉的最佳濃度為100 mmol·L-1。

    圖5 天冬氨酸鈉濃度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of sodiumasparpate concentration on the yield of ectione

    2.5 KCl濃度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

    由于KCl濃度對(duì)EctB活性的穩(wěn)定性有影響,試驗(yàn)分析了不同濃度KCl對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。如圖6所示,隨著KCl濃度的提高,四氫嘧啶產(chǎn)量隨之升高,當(dāng)KCl濃度為100 mmol·L-1時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量達(dá)到最大值0.95 mg·mL-1。當(dāng)濃度大于100 mmol·L-1時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量隨之降低。不同濃度KCl對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響差異顯著(P<0.005),KCl的最佳濃度為100 mmol·L-1。

    圖6 KCl濃度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.6 The effect of KCl concentration on the yield of ectione

    2.6 溫度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

    為了了解溫度對(duì)四氫嘧啶合成的影響,試驗(yàn)在最適天冬氨酸濃度和KCl濃度的基礎(chǔ)上,采用不同溫度對(duì)全細(xì)胞進(jìn)行催化。結(jié)果如圖7所示,25℃時(shí),四氫嘧啶的產(chǎn)率較低,隨著溫度的提高,四氫嘧啶產(chǎn)量明顯升高,但隨之也呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度為30℃,四氫嘧啶的產(chǎn)量最高,為0.94 mg·mL-1。雖然溫度為35℃時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量與30℃時(shí)四氫嘧啶產(chǎn)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),考慮到能耗原因,選擇全細(xì)胞催化生產(chǎn)四氫嘧啶的最佳溫度為30℃。

    圖7 溫度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.7 The effect of temperature on the yield of ectione

    2.7 pH對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

    由于不同pH會(huì)影響酶活性,因此在確定最適底物濃度、KCl濃度、最適溫度的基礎(chǔ)上,探究了pH對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。如圖8所示,隨著pH的提高,四氫嘧啶產(chǎn)量同樣表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),且大部分pH對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響差異顯著。當(dāng)pH為7.0時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量最高,達(dá)1.11 mg·mL-1。然而pH高于7.5后產(chǎn)量下降,當(dāng)pH為8.0時(shí),四氫嘧啶產(chǎn)量為0.8 mg·mL-1。因此,pH 7.0是全細(xì)胞催化生產(chǎn)四氫嘧啶的最適pH。

    圖8 pH對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.8 The effect of pH on the yield of ectione

    2.8 最適條件下四氫嘧啶產(chǎn)量

    在 天 冬 氨 酸 濃 度100 mmol·L-1,KCl濃 度100 mmol·L-1,溫度30℃,pH7.0的最優(yōu)條件下,測(cè)得四氫嘧啶的產(chǎn)量為1.11 mg·mL-1。

    3 討論

    自發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶以來,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、酶工業(yè)、化妝品領(lǐng)域,國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家們?cè)谄渖锖铣赏緩郊爸苽浞椒ǚ矫骈_展了大量的研究。目前,人們已經(jīng)從鏈霉菌、鹽單胞菌等多種嗜鹽菌中克隆了四氫嘧啶合成基因簇ectABC[18-21],并且通過重組表達(dá)載體,將它們導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá),實(shí)現(xiàn)了四氫嘧啶在低鹽環(huán)境下的重新合成。但研究發(fā)現(xiàn)不同來源的ectABC通過重組表達(dá)后,合成四氫嘧啶的能力有顯著差異,如高波[22]從Streptomyces pactumAct12分離出ectABC,通過pET28a在大腸桿菌BL21中表達(dá),重組菌株的四氫嘧啶產(chǎn)量較低,僅為0.437 mg·mL-1。張欣[23]從HalomonasspQHL1中分離的ectABC也通過pET28a在大腸桿菌BL21中表達(dá),四氫嘧啶產(chǎn)量達(dá)1.109 mg·mL-1。Schuben等[24]從Chromohalobacter salexigens中獲得ectABC,通過pASK-IBA7在大腸桿菌DH5α中表達(dá),重組菌株四氫嘧啶合成量高達(dá)5.9 mg·mL-1。因此克隆新的四氫嘧啶合成基因簇,以探索其在異源宿主低鹽環(huán)境下四氫嘧啶的產(chǎn)量,仍是研究的熱點(diǎn)。

    Naughton等[25]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),包括新喀里多尼亞弧菌的10類弧菌中含有ectABC基因簇,但是從弧菌中克隆ectABC,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)及合成四氫嘧啶,尚未有報(bào)道。本研究從弧菌中獲得的四氫嘧啶合成基因簇ectABC,通過pBAD表達(dá)載體在BW25113中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá),且在最佳全細(xì)胞催化條件下,當(dāng)細(xì)胞密度OD600為5時(shí),獲得的重組菌株四氫嘧啶合成量為1.11 mg·mL-1。與一些高產(chǎn)四氫嘧啶菌株相比,本研究獲得的重組菌株四氫嘧啶產(chǎn)量略低,但要遠(yuǎn)高于高波[22]、魏偉偉[26]等構(gòu)建的ectABC重組菌株產(chǎn)量。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是不同來源的嗜鹽菌中ectABC基因簇編碼ectA、ectB、ectC蛋白序列存在差異。序列分析顯示本研究中ectA、ectB、ectC與其他細(xì)菌來源ectA、ectB、ectC的同源性在60%以下,這可能導(dǎo)致重組表達(dá)的ectA、ectB、ectC蛋白酶活性存在差異,從而影響四氫嘧啶的合成。陳永濤等[27]的研究結(jié)果也顯示,不同來源的ectABC簇構(gòu)建的工程菌株生產(chǎn)四氫嘧啶,產(chǎn)量之間有顯著的差異。此外,全細(xì)胞催化時(shí)細(xì)胞密度對(duì)四氫嘧啶的合成也有影響。如He[28]等研究發(fā)現(xiàn),將來自Halomonas elongata的ectABC通過全細(xì)胞催化,當(dāng)發(fā)酵罐中細(xì)胞密度OD600為5時(shí),產(chǎn)量達(dá)到2.67 mg·mL-1,當(dāng)細(xì)胞密度OD600為20時(shí),產(chǎn)量達(dá)到了25.1 mg·mL-1。因此,下一步將通過發(fā)酵罐來生產(chǎn)四氫嘧啶,并探討細(xì)胞密度對(duì)四氫嘧啶產(chǎn)量的影響,同時(shí)也將開展分離純化實(shí)驗(yàn),為工業(yè)化生產(chǎn)四氫嘧啶奠定基礎(chǔ)。

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