二甲雙胍對膠質母細胞瘤細胞的抑制作用研究

孫夢婷，趙鵬翔，儀楊，王濛，謝飛，ADZAVON Yao Mawulikplimi，劉夢昱

北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124

在成人腦腫瘤中，膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見且惡性程度最高的腫瘤。根據(jù)GBM獨特的組織學特征，即腫瘤壞死區(qū)及內(nèi)皮細胞增殖程度，世界衛(wèi)生組織將其歸類為最高級別Ⅳ級腦腫瘤（Lah，Novak and Breznik）［1］。確診后，GBM患者的生存期一般只有15個月左右［2］。GBM分為原發(fā)性GBM和繼發(fā)性GBM，兩類GBM具有不同的分子發(fā)生機制。在老年患者中，GBM主要為原發(fā)性腫瘤，該類患者未曾患有惡性程度較輕的腦腫瘤。繼發(fā)性GBM來源于低等級腦膠質瘤的復發(fā)［3］。GBM的標準治療手段為最大程度安全地進行手術切除聯(lián)合放化療治療［4］。替莫唑胺作為小分子藥物能夠穿過血腦屏障，一直作為一線用藥應用于GBM的臨床治療中，近年來隨著抗腫瘤藥物的研究發(fā)展，貝伐珠單抗、洛莫司丁以及腫瘤電場治療也可作為輔助治療手段參與到GBM的治療中［5-7］。然而，盡管膠質母細胞瘤的治療方法在不斷進步，患者五年生存率仍低于10%［8］，因此新的治療方法以及抗腫瘤藥物亟待研發(fā)。

二甲雙胍（metformin hydrochloride，MET）是治療2型糖尿病的一線雙胍類藥物［9］。二甲雙胍在不同疾病中顯示出了多效性，提示其不依賴于控制血糖而對多種組織器官產(chǎn)生作用。二甲雙胍的親水及親脂性使其可以高度溶解于無機液相介質中，且易與膜脂質結構結合，使得二甲雙胍可輕易穿過血腦屏障［10］。Labuzek等［11］研究發(fā)現(xiàn)全身炎癥Wistar大鼠模型口服二甲雙胍后，藥物可透過血腦屏障，在腦不同部位的血藥濃度均在μmol范圍內(nèi)。針對多種疾病的多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍經(jīng)注射給藥后血藥濃度均在40μmol·L-1內(nèi)，符合藥理學血藥濃度標準，為二甲雙胍抗膠質母細胞瘤治療提供了實驗基礎。研究表明二甲雙胍的抗腫瘤作用機制包括AMPK依賴或AMPK非依賴方式［12］。二甲雙胍能夠通過激活細胞AMPK抑制下游mTOR信號通路而具有潛在的抗腫瘤作用。而AMPK非依賴在體內(nèi)的作用包括降低胰島素、抑制炎癥信號以及增強脂聯(lián)素等，這些變化在腫瘤的生成過程中均具有重要的調控作用［13-14］。近年來多項研究結果顯示，二甲雙胍在多類良性或惡性腫瘤中發(fā)揮了抑制作用，在結腸癌、乳腺癌以及前列腺癌的治療效果中得到了證實［14-16］。因此，本研究選擇多種膠質母細胞瘤細胞系作為研究對象，探討二甲雙胍在體外是否對不同膠質母細胞瘤細胞具有抑制作用，以期為進一步開展二甲雙胍治療膠質母細胞瘤的研究提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞小鼠源膠質瘤細胞株（GL261）購自北京協(xié)和醫(yī)院細胞庫；大鼠源膠質瘤細胞株（C6）購自國家實驗細胞資源共享平臺（北京總部）；人源膠質瘤細胞株（U87MG）來源于北京陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院。

1.1.2 試劑二甲雙胍鹽酸鹽（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；CCK-8試劑盒、CCK-L試劑盒（日本Dojiodo公司）；NucGreen Dead488ReadyProbes（美國Thermo Fisher公司）；細胞全蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；p-Akt、Akt抗體（美國CST公司）；β-actin抗體（美國Proteintech公司）；熒光二抗（鼠抗、兔抗）（美國KPL公司）。

1.1.3 實驗儀器CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；光學（熒光）倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；低速離心機（江蘇瑞江分析儀器有限公司）；高速離心機（美國EPPENDORF公司）；六合一酶標儀、核酸電泳儀（美國BIO-RAD公司）；Odyssay凝膠成像儀（美國LI-COR公司）；細胞實時成像系統(tǒng)（美國BioTex公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)含10% FBS和1%鏈青霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，每3天傳代1次，傳代比例為1∶3。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性將處于對數(shù)生長期的細胞按3×103個·孔-1接種于96孔板內(nèi)，貼壁24 h。顯微鏡下觀察到細胞貼壁并且生長良好時，加入完全培養(yǎng)基（0 mmol·L-1）和含不同濃度二甲雙胍（2、4、6、8、10 mmol·L-1）的完全培養(yǎng)基，作用時間分別為24、48、72 h。每孔按照體系體積的10%加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，在波長450 nm處檢測吸光度，按照公式（1）計算細胞相對增殖活性（細胞存活率）。

式中，As：實驗孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測物質）吸光度值；Ac：對照孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無待測物質）吸光度值；Ab：空白孔（不含細胞和待測物質的培養(yǎng)基、CCK-8）吸光度值。

1.2.3 活細胞實時成像實驗細胞接種密度及實驗分組同1.2.2，同時將75%乙醇處理細胞5 min設置陽性對照組。GL261、C6按照以下分組：對照組（CTRL組）、實驗組（MET組，6 mmol·L-1）。U87MG按照以下分組：對照組（CTRL組）、實驗組（MET組，8 mmol·L-1）。NucGreen Dead 488 ReadyProbes染料和培養(yǎng)基比例為1∶400。按照實驗分組加入培養(yǎng)基及染料，避光放入活細胞成像系統(tǒng)監(jiān)測48 h，觀察凋亡情況。

1.2.4 平板克隆實驗 將細胞按照GL261（100個·孔-1）、C6（200個·孔-1）、U87MG（200個·孔-1）的細胞密度接種于24孔板。GL261、C6按照以下分組：對照組（CTRL組）、實驗組（MET組，6 mmo·lL-1）、實驗組（MET組，8 mmol·L-1）；U87MG按照以下分組：對照組（CTRL組）、實驗組（MET組，8 mmol·L-1）、實驗組（MET組，10 mmol·L-1）。連續(xù)培養(yǎng)7 d，隔天更換培養(yǎng)基，單個細胞克隆達到50個左右，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，拍照。4倍顯微鏡觀察細胞團狀態(tài)，并按照公式（2）計算克隆形成率。

1.2.5 活細胞ATP檢測細胞接種密度同1.2.2，分組同1.2.3，作用時間為48 h。每孔加入100μL CCK-L工作液，25℃避光孵育10 min，酶標儀全波長檢測相對光強度（relative light unit，RLU）。

1.2.6 Western blot實驗分組同1.2.3，二甲雙胍處理12、24、48 h后收集細胞。參照試劑盒操作說明提取細胞全蛋白，考馬斯亮藍法測蛋白濃度，上樣量為40μg，SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜至硝酸纖維素膜。5% BSA或5%脫脂牛奶室溫封閉。一抗p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶8 000）孵育。熒光二抗（1∶10 000）孵育，LI-COR成像系統(tǒng)直接掃描，Odyssey軟件統(tǒng)計灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究均采用GraphPad Prism 9.0.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示，組間差異比較采用t檢驗（t-test）、單因素方差分析（one-way ANOVA）或雙因素方差分析（two-way ANOVA），組間比較P＜0.05、P＜0.001、P＜0.000 1表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 二甲雙胍對GBM細胞增殖的影響

2.1.1 二甲雙胍對不同GBM細胞增殖活性的影響CCK-8實驗結果如圖1所示：與對照組（0 mmol·L-1）相 比，二 甲 雙 胍 在 較 低濃 度2～4 mmol·L-1時，對各組GBM細胞的活性無明顯抑制作用，在較高濃度時（≥6 mmol·L-1）對各組GBM細胞增殖水平均產(chǎn)生了明顯的抑制作用。CCK-8結果發(fā)現(xiàn)，不同GBM細胞對二甲雙胍的藥物敏感性不同，二甲雙胍藥物作用時間不同也對GBM細胞活性產(chǎn)生了不同的影響。如圖1所示，與GL261、C6相比，U87MG具有較高的耐藥性，二甲雙胍濃度達到8 mmol·L-1且作用時間48 h后，U87MG細胞相對活性為54.268%±4.442%。對于C6細胞，隨著藥物濃度增加及作用時間增加對細胞增殖的抑制作用逐漸增強。GL261增殖能力較強，二甲雙胍作用時間達到72 h，藥物對細胞的抑制能力顯著降低，藥物作用48 h對GL261細胞U87MG細胞具有較強的抑制作用。綜上，二甲雙胍作用48 h對各組GBM細胞均產(chǎn)生了抑制作用，各組細胞半數(shù)抑制率藥物濃度（IC50）及作用 時 間 為：U87MG，8 mmol·L-1作 用 時 間48 h（54.268%±4.442%）；C6，6 mmol·L-1作用時間48 h（53.388%±1.521%）；GL261，4 mmol·L-1作用時間48 h（58.9175%±9.670%）。

圖1 二甲雙胍對GBM細胞的增殖活性的影響Fig.1 Effect of MET on proliferation activity of GBM cells

2.1.2 二甲雙胍對GBM細胞形態(tài)學變化的影響10倍顯微鏡下觀察GBM細胞形態(tài)，結果如圖2所示：與對照組相比，MET組視野中GL261、C6和U87MG細胞變圓、皺縮細胞數(shù)量增加，細胞密度降低。這與CCK-8實驗結果相對應，證明二甲雙胍明顯抑制各GBM細胞的增殖和生長。

圖2 二甲雙胍對GBM細胞形態(tài)的影響(×10)Fig.2 Effect of MET on GBM cell morphology

2.2 二甲雙胍對GBM細胞凋亡水平的影響

NucGreen Dead 488 ReadyProbes染料可與凋亡細胞的核DNA結合，發(fā)出綠色熒光，對生長狀態(tài)正常的細胞無影響。10倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖3），MET可在24 h內(nèi)有效促進U87MG細胞凋亡，而對GL261和C6細胞凋亡促進作用無明顯變化；48 h內(nèi)可有效促進3種GBM細胞大量凋亡，明場中3種GBM細胞的數(shù)量無明顯變化，說明二甲雙胍能夠顯著抑制GBM細胞增殖。由于不同GBM細胞自身代謝水平及增殖水平的差別，MET對不同GBM細胞發(fā)揮促凋亡作用的時間不同，促進GBM凋亡的具體分子機制尚需進一步實驗驗證。

圖3 二甲雙胍對GBM細胞凋亡水平的影響Fig.3 Effect of MET on apoptosis of GBM cells

2.3 二甲雙胍對GBM細胞克隆形成的影響

二甲雙胍分別處理GL261、C6和U87MG細胞7 d后，如圖4所示，克隆形成實驗結果顯示二甲雙胍處理后的GBM細胞形成克隆數(shù)與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），MET組細胞克隆能力明顯低于對照組，且隨著作用濃度增加，二甲雙胍對GBM細胞的抑制作用增強，形成的克隆細胞團內(nèi)細胞數(shù)目也顯著減少。4倍顯微鏡下觀察克隆細胞團形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MET組中GBM形成細胞團的能力明顯降低，克隆細胞團中細胞間空隙明顯增大（圖5）。綜上，證明二甲雙胍能夠有效抑制GBM細胞的克隆形成能力，并具有一定的劑量依賴性。

圖4 二甲雙胍對GBM細胞克隆形成的影響Fig.4 Effects of MET on the formation of GBM cell clonies

圖5 二甲雙胍對GBM克隆細胞團形態(tài)的影響Fig.5 Effect of MET on cell cluster morphology of GBM clonies

2.4 二甲雙胍對GBM細胞內(nèi)ATP水平的影響

研究表明二甲雙胍能夠通過抑制線粒體復合物Ⅰ對細胞產(chǎn)生抑制作用，本研究通過化學發(fā)光法（CCK-L）對GBM細胞的活細胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生的ATP水平進行檢測。與對照組相比，MET組的相對光強度（RLU）明顯降低（圖6）。ATP作為細胞的能量貨幣，直接為細胞代謝提供能源，結果證明二甲雙胍能夠顯著抑制各GBM細胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生ATP，從能量來源處抑制了細胞增殖及生長。

圖6 二甲雙胍對GBM細胞內(nèi)ATP水平的影響Fig.6 Effect of MET on intracellular ATP level in GBM cells

2.5 二甲雙胍對GBM細胞Akt及磷酸化水平的影響

檢測不同時間點下二甲雙胍作用對GBM細胞中p-Akt、Akt表達的影響，如圖7所示：與各自時間點的對照組相比，隨著二甲雙胍作用時間延長，3種GBM細胞內(nèi)p-Akt表達在12 h并未出現(xiàn)顯著差異，在24 h出現(xiàn)顯著下調（P＜0.000 1）；48 h僅C6細胞內(nèi)p-Akt表達下調明顯（P＜0.05），其余細胞Akt表達水平在12～48 h內(nèi)并未出現(xiàn)顯著差異，證明二甲雙胍通過抑制Akt磷酸化進而抑制GBM細胞內(nèi)Akt活化，對p-Akt表達具有短效性作用，且無時間依賴性。

圖7 二甲雙胍對Akt及其磷酸化水平的影響Fig.7 Effect of MET on Akt and its phosphorylation level

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能具有新的作用，不僅能夠因其具有降糖作用而成為2型糖尿病的一線用藥，同時在臨床應用上還發(fā)現(xiàn)其對腫瘤有抑制作用。其作用效果在多種腫瘤中得到驗證，如乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌以及腦膠質瘤［17］。而GBM作為惡性程度最高的腦膠質瘤，患者可選擇的治療方案十分有限，且效果甚微。研究表明，放療和化療或可提高標準治療效果，大量臨床病例也顯示聯(lián)合放化療治療方法會抑制腫瘤生長和限制復發(fā)，從而使挽救病人生命成為可能，然而治療后GBM患者的5年生存率仍難以提高［18］。在抗腦膠質瘤的體內(nèi)外實驗中，二甲雙胍常與其他藥物，例如替莫唑胺、二氯乙酸（DCA）等聯(lián)合作用于U251、T98等膠質瘤細胞系或C57BL/6小鼠GL261移植瘤模型進行研究［19-21］。本研究結果與上述文獻中的結果一致，證明了二甲雙胍可有效地抑制不同GBM細胞的增殖能力，且有一定濃度依賴性。本研究中CCK-8結果確定了不同GBM細胞適合的藥物作用濃度。實時細胞檢測GBM細胞的動態(tài)生長狀況進一步驗證了二甲雙胍作用后促進GBM細胞凋亡的有效作用時間，為進一步的實驗研究提供了最重要的理論基礎。已有研究結果表明，在不同GBM細胞中二甲雙胍作用濃度不同，提示種屬、組織與惡性程度不同的GBM細胞的增殖及代謝水平不同，使得二甲雙胍抑制腫瘤細胞的有效濃度不同。本研究僅在體外探究了二甲雙胍單獨作用于GBM細胞的作用效果，未結合體外實驗，且二甲雙胍作用機制十分復雜，許多二甲雙胍抗膠質瘤的相關研究僅局限于多藥聯(lián)合作用的基礎實驗，將二甲雙胍單獨應用于體內(nèi)的實驗研究較少。因此，后續(xù)將對二甲雙胍單獨作用動物的體內(nèi)實驗進行研究，并進一步驗證二甲雙胍在臨床研究中的抗腫瘤效應。

盡管研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠對腫瘤細胞的代謝產(chǎn)生影響，但其真正的作用機制尚待研究［22-23］。已有研究表明二甲雙胍作用后涉及多種信號通路，包括AMPK、mTOR、REDD1以及細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈及氧化應激的調控［24-27］。本研究首先對GBM細胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生的ATP水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用后，不同GBM細胞內(nèi)ATP水平均顯著降低，證明了二甲雙胍對腫瘤細胞代謝功能的抑制作用。Akt是腫瘤細胞信號通路中重要的調控因子，該因子通過自身磷酸化和去磷酸化調控下游信號轉導，從而影響細胞能量代謝水平，并與體內(nèi)多種腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和凋亡過程等相關。本研究結果證明二甲雙胍作用后，多種GBM細胞內(nèi)Akt磷酸化水平顯著降低。

綜上所述，二甲雙胍可抑制多種GBM細胞的增殖，降低Akt磷酸化水平，其機制或與細胞內(nèi)ATP水平降低密切相關，本研究結果為二甲雙胍用于GBM的防治及GBM患者治療提供了新的思路與途徑。