孕期地塞米松暴露對(duì)大鼠子代海馬神經(jīng)元增殖以及突觸可塑性的影響

秦佳鑫，姚寶珍

武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科，武漢 430060

胎兒發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)受到宮內(nèi)環(huán)境的影響，不良環(huán)境暴露可導(dǎo)致子代海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)異常以及發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶改變。已有研究證明，暴露于糖皮質(zhì)激素、抗炎、抗癲癇、抗精神病等多種藥物［1-2］均可通過(guò)減少海馬神經(jīng)增殖分化以及增加海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制使海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、密度降低以及海馬的突觸可塑性［3］改變。

地塞米松是一種糖皮質(zhì)激素藥物，具有抗炎、抑制免疫、抗休克及增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，廣泛應(yīng)用于治療多種疾病，如自身免疫性疾病、過(guò)敏、炎癥、哮喘及皮膚病等。臨床上常使用地塞米松來(lái)促進(jìn)早產(chǎn)兒的肺成熟以及孕期預(yù)防胎兒呼吸窘迫綜合征，是目前較為公認(rèn)的孕期安全用藥。前期實(shí)驗(yàn)表明，孕期地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure，PDE）可導(dǎo)致大鼠子代空間記憶以及學(xué)習(xí)缺陷［4］。在PDE的恒河猴模型中，海馬CA區(qū)錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒神經(jīng)元數(shù)量減少以及苔蘚纖維的軸突突觸末端顯示出明顯的變性現(xiàn)象［5］。此外，孕期暴露于地塞米松會(huì)導(dǎo)致子代癲癇、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率增高［6-7］。因此，我們提出PDE可能導(dǎo)致子代海馬發(fā)育不良。

在大腦的正常運(yùn)作過(guò)程中，正常的神經(jīng)功能取決于神經(jīng)元連接的精確模式，而這又取決于成熟大腦中存在的數(shù)萬(wàn)億個(gè)突觸［8］。為了滿(mǎn)足動(dòng)物在不斷變化的環(huán)境中的生存要求，無(wú)論是結(jié)果還是功能上，突觸都不是一成不變的，而是會(huì)經(jīng)歷持續(xù)的變化，這被稱(chēng)為突觸的可塑性［9］。多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如自閉癥、抑郁癥、阿爾茲海默癥等［10-13，15，17］，均與突觸數(shù)量以及突觸可塑性改變有關(guān)。此前有研究證明APPL1（adaptor protein containing pH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1）可充當(dāng)連接神經(jīng)元活動(dòng)與基因轉(zhuǎn)錄的連接器，該途徑有助于突觸可塑性的修飾，故其對(duì)突觸可塑性有不容忽視的作用［14-15］。本文探究了PDE導(dǎo)致子代海馬突觸可塑性受損是否與APPL1的改變相關(guān)，提出PDE可能通過(guò)調(diào)控APPL1的表達(dá)從而影響子代海馬突觸可塑性的損傷。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與處理

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，該中心已獲得國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理評(píng)估與認(rèn)證協(xié)會(huì)（AAALAC International）的認(rèn)可。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均在中國(guó)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行。

建立地塞米松暴露大鼠模型，適應(yīng)性喂養(yǎng)Wistar大鼠一周后進(jìn)行繁殖和交配。于合籠后次日進(jìn)行陰道檢查，確認(rèn)妊娠當(dāng)日記為GD0。將妊娠大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和PDE組。從妊娠第9天至妊娠第20天，兩組大鼠分別皮下注射地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1和等量的0.9%氯化鈉溶液。在GD20當(dāng)天，將孕鼠用異氟醚麻醉，然后處死。每組胎仔數(shù)在8～14只的懷孕大鼠標(biāo)記為合格，取出胎鼠。每組隨機(jī)取5個(gè)全腦，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片。從同窩中收集的剩余胎兒海馬樣本被匯集在一起，立即在液氮中冷凍后保存在-80℃，以作進(jìn)一步分析。

1.2 材料

1.2.1 試劑PSD95（A6194）、GAPDH（AC002）的抗體均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；總RNA提取劑Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；4%多聚甲醛固定購(gòu)于北京艾斯本技術(shù)有限公司；異氟醚購(gòu)于美國(guó)Baxter Healthcare有限公司；逆轉(zhuǎn)錄和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒購(gòu)自TaKa-Ra生物技術(shù)有限公司；所有引物均由天一匯源生物科技有限公司合成。

1.2.2 設(shè)備分光光度計(jì)和ABI Step One RT-PCR熱循環(huán)儀購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)于北京生物科技公司；石蠟組織切片機(jī)購(gòu)于湖南榮和科技公司；高速離心機(jī)購(gòu)于上海佳德儀器公司；凈化工作臺(tái)購(gòu)于蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)提取總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度，調(diào)整RNA濃度為1μg·μL-1。使用2μg總RNA制備單鏈cDNA（引物見(jiàn)表1）。RT-qPCR在10μL反應(yīng)混合物中進(jìn)行。為了更精確地量化基因轉(zhuǎn)錄本，將管家基因GAPDH的mRNA水平作為定量對(duì)照。相對(duì)擴(kuò)增子表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR中引物序列及反應(yīng)條件Table 1 Primer sequences and reaction conditions used in quantitative real-time PCR

1.3.2 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析從海馬組織中提取蛋白質(zhì)樣品。使用BCA測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)過(guò)上樣、電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，再將膜與一抗在4℃下孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次后，加入抗小鼠GAPDH（1：5 000）二抗孵育。最后，使用ECL Plus試劑盒可視化蛋白質(zhì)條帶，平均光密度代表蛋白質(zhì)的相對(duì)水平。

1.3.3 透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)每組分別隨機(jī)選取雌、雄各3只胎鼠，斷頭，在冰上快速分離海馬，切取1 mm3海馬CAl區(qū)組織塊，使用2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h，按常規(guī)制作電鏡標(biāo)本，使用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)改變。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和PAE組的平均值。多組比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，然后采用dunnett-t檢驗(yàn)確定兩組之間的顯著差異。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDE對(duì)雌雄子代海馬神經(jīng)增殖的影響

增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。Ki67是增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中是不可缺少的。與對(duì)照組相比，PDE子代海馬雌雄性高劑量組PCNA、ki67均出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖1）。提示PDE可致子代海馬神經(jīng)增殖減少。

圖1 子代胎鼠海馬增殖指標(biāo)表達(dá)變化Fig.1 Changes of hippocampal apoptosis index in offspring fetal rats

2.2 PDE對(duì)雌雄子代海馬神經(jīng)凋亡的影響

Caspase-3是一種蛋白酶，其在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，是反映細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PDE雌雄子代Caspase-3均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，圖2）。提示PDE可致子代海馬神經(jīng)凋亡增加。

圖2 子代胎鼠海馬凋亡指標(biāo)表達(dá)變化Fig.2 Changes of hippocampal apoptosis index in offspring fetal rats

2.3 PDE對(duì)雌雄子代海馬突觸可塑性的影響

突觸融合蛋白（Syntaxin）、25 kD突觸相關(guān)蛋白（SNAP25）在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和軸突生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用，可作為突觸的相關(guān)性指標(biāo)。RT-qPCR結(jié)果顯示PDE子代海馬中Syntaxin以及SNAP25出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖3）。Western-blot結(jié)果顯示高劑量PDE子代海馬中突觸后致密蛋白95（PSD95）出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖3）。提示PDE可致子代海馬突觸可塑性受損。

圖3 子代胎鼠海馬突觸指標(biāo)表達(dá)變化Fig.3 Changes of hippocampal synapse index in offspring fetal rats

2.4 PDE致雌雄子代海馬突觸可塑性受損

投射電鏡結(jié)果顯示（圖4），對(duì)照組中突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸后致密帶密度較高。地塞米松暴露組突出結(jié)構(gòu)模糊，突觸后致密帶密度降低，PSD厚度顯著減少，且突觸間隙顯著增寬。提示PDE可致子代海馬突觸可塑性受損。

圖4 各組海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of hippocampal CA1 area in each group

2.5 PDE通過(guò)調(diào)節(jié)APPL1介導(dǎo)子代海馬突觸可塑性受損

APPL1是含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白，有研究表明其定位于樹(shù)突棘和突觸，并調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的發(fā)育。RT-qPCR結(jié)果顯示PDE子代海馬中APPL1轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖5）。提示PDE可能通過(guò)調(diào)控海馬中APPL1的表達(dá)從而影響子代海馬突觸可塑性。

圖5 子代胎鼠海馬APPL1 mRNA表達(dá)變化Fig.5 Change of hippocampal APPL1 mRNA expression in offspring fetal rats

3 討論

地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素藥物，其在臨床上應(yīng)用廣泛，婦產(chǎn)科常用于多種早產(chǎn)有關(guān)疾病的治療。由于早產(chǎn)兒肺部多不成熟，可能會(huì)導(dǎo)致呼吸窘迫綜合征的發(fā)生，降低了胎兒的生存率，故臨床上多在孕晚期使用地塞米松來(lái)達(dá)到促進(jìn)胎兒肺成熟的目的［16］。然而，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，產(chǎn)前使用地塞米松會(huì)造成子代不良損傷［17-19］。目前臨床地塞米松用藥劑量標(biāo)準(zhǔn)常為0.05～0.2 mg·kg-1·d-1［20］，按照人和大鼠的劑量轉(zhuǎn)換關(guān)系（人∶大鼠=1∶6.17）計(jì)算本研究中使用0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松暴露量相當(dāng)于0.03 mg·kg-1·d-1人群用藥劑量。因此，本研究在實(shí)驗(yàn)中使用的地塞米松劑量是合理的，具有臨床現(xiàn)實(shí)意義。

目前，關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)已有較多研究，其中神經(jīng)發(fā)生假說(shuō)受到越來(lái)越多的關(guān)注和研究，該假說(shuō)聚焦于海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生減少。海馬神經(jīng)發(fā)生是指從神經(jīng)干細(xì)胞增殖分裂成為定向神經(jīng)祖細(xì)胞，并逐漸向功能區(qū)域遷移產(chǎn)生神經(jīng)功能的完整過(guò)程。其中神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖活動(dòng)是海馬神經(jīng)發(fā)生中的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)祖細(xì)胞增殖障礙會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生異常［21］。此外，神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化及其功能在神經(jīng)精神性疾病的發(fā)病機(jī)制和疾病治療中極其重要，有研究發(fā)現(xiàn)在癲癇［22-23］、阿爾茲海默癥、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有可能存在神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)生減少現(xiàn)象；也有研究基于精神分裂癥患者的神經(jīng)祖細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選以得到更為有效的治療靶點(diǎn)［24］。突觸是神經(jīng)元信號(hào)傳遞的重要結(jié)構(gòu)，神經(jīng)突觸可塑性被認(rèn)為是神經(jīng)回路發(fā)育以及記憶與學(xué)習(xí)功能的基礎(chǔ)，其異?？蓪?dǎo)致多種神經(jīng)疾病發(fā)生，例如癲癇、抑郁癥和阿爾茲海默癥等［25-27］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PDE可致子代胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生減少，主要包括增殖減少以及凋亡增多兩方面，進(jìn)一步檢測(cè)PDE子代海馬突觸相關(guān)發(fā)育指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，PDE會(huì)導(dǎo)致子代海馬突觸可塑性受損。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其在任何時(shí)間節(jié)點(diǎn)受到破壞都可能對(duì)大腦的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴(yán)重而持久的影響。在宮內(nèi)，腦的發(fā)育受到基因和環(huán)境的雙重影響［28-29］。由于孕期使用地塞米松的不完全安全性，本實(shí)驗(yàn)探究孕期地塞米松暴露與子代海馬發(fā)育的關(guān)系，證實(shí)了孕期地塞米松暴露會(huì)導(dǎo)致子代海馬神經(jīng)發(fā)育損傷以及突觸可塑性改變，未來(lái)實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步對(duì)孕期地塞米松暴露是否導(dǎo)致子代神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感以及其可能的機(jī)制進(jìn)行探究，這將對(duì)于臨床地塞米松用藥有一定借鑒意義。