基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)黃甲軟肝顆?？垢卫w維化作用及驗(yàn)證研究

蔡 強(qiáng) 張 苗 黃朝情 張 榮 楊 蕾 王宗權(quán)

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)(廣州 510000)

2 北京盈科瑞藥物研究院有限公司(北京 100000)

3 盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司，國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心新型遞藥系統(tǒng)分中心，廣東省霧化吸入制劑工程技術(shù)研究中心(珠海 519000)

肝纖維化是一種嚴(yán)重的健康問題，在全球范圍內(nèi)普遍存在且預(yù)后較差，可響應(yīng)幾乎所有引起慢性肝損傷的原因，包括酒精中毒、非酒精性肝脂肪性肝炎、慢性病毒性肝炎和自身免疫性疾病[1]。肝纖維化的特征是由于細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解之間的不平衡，導(dǎo)致肝內(nèi)的沉積過(guò)多[2]。肝星狀細(xì)胞的激活已被確認(rèn)為肝纖維化發(fā)展中的關(guān)鍵事件，它調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的大量生產(chǎn)和分泌[3]。肝纖維化被認(rèn)為是可逆的病理生理過(guò)程，其晚期會(huì)導(dǎo)致肝硬化[4]、肝衰竭和門脈高壓，可能需要進(jìn)行肝移植。肝纖維化的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)是預(yù)防和治療慢性肝病的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前，仍然沒有批準(zhǔn)用于人類的有效抗纖維化藥物。因此，開發(fā)有效且安全的抗纖維化藥物并揭示其潛在機(jī)制至關(guān)重要。中藥由于其療效好，不良反應(yīng)少而在中國(guó)的臨床實(shí)踐中一直使用了數(shù)千年，已成為當(dāng)前醫(yī)療體系中不可或缺的一部分[5]。臨床證明中醫(yī)在預(yù)防和治療肝纖維化和肝硬化方面具有獨(dú)特的功效和優(yōu)勢(shì)。

黃甲軟肝顆粒是純中藥復(fù)方制劑，來(lái)源于北京模式口中醫(yī)院劉源院長(zhǎng)祖?zhèn)鞫嗄甑拿胤?，后?jīng)劉源院長(zhǎng)幾十年臨床實(shí)踐總結(jié)而得。由黃芪、鱉甲、靈芝等10 味中藥組成。具有益氣舒肝，活血軟堅(jiān)的功效。用于肝纖維化和早期肝硬化，脾虛肝郁，氣血瘀阻證。癥見脅肋刺痛或脹痛，食欲不振，脘腹脹滿，大便溏爛，神疲乏力，面色晦暗，舌暗，苔薄，脈弦。但目前尚未揭示黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析的原理，由于各種生物信息學(xué)資源的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法已成功應(yīng)用于中藥有效成分及其分子機(jī)理的發(fā)現(xiàn)。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的中藥研究值得探索。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化中的活性成分和作用機(jī)制，為黃甲軟肝顆粒減輕肝臟纖維化和恢復(fù)肝功能的功效機(jī)制研究提供一定的的方向。

1 材料與方法

1.1 黃甲軟肝顆?；钚猿煞值墨@取及靶點(diǎn)刷選

查找相關(guān)中藥活性成分依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)：http://tcmspw.com/tcmsp.php)[6]收集黃甲軟肝顆粒全方中 10味中藥黃芪、鱉甲、葛根、柴胡、靈芝、赤芍、丹參、三七、雞骨草、葉下珠的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度和類藥性篩選，篩選閾值分別為口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18[7]。通過(guò) TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)尋找與活性成分相關(guān)的靶標(biāo)蛋白，通過(guò)Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.Unitprot.org/)查詢靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因名稱，選擇人類的靶點(diǎn)蛋白，最終確定黃甲軟肝顆粒的活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 肝纖維化靶點(diǎn)刷選

在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)[8]中輸入“Liver Fibrosis”，收集肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)，將所得靶點(diǎn)取并集，并將重復(fù)項(xiàng)刪除，以得到肝纖維化的相關(guān)靶標(biāo)信息。

1.3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將所得活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)蛋白與肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，即兩者取交集，得到黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建構(gòu)建“C(成分)-T(靶點(diǎn))”作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO富集與KEGG通路富集分析

為了分析黃甲軟肝顆粒作用于肝纖維化的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路傳導(dǎo)過(guò)程，繼而進(jìn)一步預(yù)測(cè)藥物機(jī)制，采用 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)[9]對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 富集與KEGG通路富集。通過(guò)Omicshare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5 SD大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠36只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2018- 0085；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018- 0034。

1.5.2 藥物與試劑 黃甲軟肝顆粒：盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司；陽(yáng)性對(duì)照藥為水飛薊素(純度>80%)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(批號(hào)C0105)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C010- 2- 1)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C009- 2- 1)：南京建成生物工程研究所。

1.5.3 主要儀器 分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；高速低溫離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀：PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH；顯微鏡:日本Olympus公司。

1.5.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境溫度及濕度均適宜的SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間每天日照12 h。適宜1周后，將大鼠隨機(jī)分成6組：對(duì)照組、模型組、水飛薊素組、黃甲軟肝顆粒低、中、高劑量組。每組6只。除正常組外，其余各組采用灌胃給予 20% CCl4橄欖油溶液(3 mL/kg)，正常組給予相應(yīng)橄欖油，每周2次，連續(xù)10周，誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型。于造模第2天起，給藥組分別灌胃給予相應(yīng)的受試藥物，水飛薊素組按照每日25 mg/kg的劑量灌胃給予水飛薊素，黃甲軟肝顆粒低劑量組按照每日1.16 g/kg的劑量灌胃給予黃甲軟肝顆粒，黃甲軟肝顆粒中劑量組按照每日2.32 g/kg的劑量灌胃給予黃甲軟肝顆粒，黃甲軟肝顆粒高劑量組按照每日4.64 g/kg的劑量灌胃給予黃甲軟肝顆粒，正常組和模型組分別灌胃給予相應(yīng)飲用水，每天1次，連續(xù)10周。末次給藥后，過(guò)夜禁食不禁水，大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，-80 ℃保存。各組大鼠處死后取肝臟，稱取肝臟重量，切取肝臟大葉邊緣相同部位與4%多聚甲醛中固定，用于病理學(xué)觀察，其余部分分裝于凍存管，置-80 ℃保存。

1.5.5 肝臟指數(shù)的測(cè)定 肝臟指數(shù)：肝指數(shù)(%)=肝濕重/末次體質(zhì)量×100(%)。

1.5.6 血清AST和ALT的測(cè)定 血清直接取樣進(jìn)行測(cè)定，按照AST和ALT試劑盒說(shuō)明，采用微板法檢測(cè)血清中AST和ALT含量，評(píng)價(jià)各組大鼠肝功能。

1.5.7 大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察 用4%多聚甲醛固定肝臟后，依次經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm厚度病理組織切片，進(jìn)行HE染色，觀察組織病理學(xué)。

1.5.8 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行Dunnett多重比較檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以SEM均值表示，統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分與靶點(diǎn)獲取

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集黃甲軟肝顆粒的活性成分基本信息，以利用度≥30%和藥物相似度≥0.18%篩選，剔除掉未找到靶點(diǎn)的化學(xué)成分，得到活性化合物208個(gè)，其中黃芪 20個(gè)、鱉甲0個(gè)、葛根 4 個(gè)、柴胡17個(gè)、靈芝61個(gè)、赤芍29個(gè)、丹參65個(gè)、三七8個(gè)、雞骨草4個(gè)、葉下珠0個(gè)；相關(guān)靶標(biāo)共2 398個(gè)，見表1。將活性成分和相關(guān)靶標(biāo)綜合篩選保留唯一值，共搜集到117個(gè)活性成分，266個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)“網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 “活性成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)“網(wǎng)絡(luò)

表1 黃甲軟肝顆?！爸兴?活性成分-相關(guān)靶標(biāo)”信息

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索肝纖維化所得結(jié)果進(jìn)行并集，刪除重復(fù)項(xiàng)，得到肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)6 398個(gè)。

2.3 “成分-靶點(diǎn)”構(gòu)建與結(jié)果分析

將所得到的黃甲軟肝顆粒的藥物靶點(diǎn)與肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到161個(gè)共有靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)黃甲軟肝顆?；钚猿煞?17個(gè)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建的C(成分)-T(靶點(diǎn))網(wǎng)絡(luò)見圖2。 靶點(diǎn)數(shù)排前10位的成分為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、7-O-methylisomucronulatol、甾醇(beta-sitosterol)、二氫丹參內(nèi)酯(dihydrotanshinlactone)、丹參酮IIA(tanshinone iia)、刺芒柄花素(formononetin)、糖甙(isorhamnetin)、4-亞甲丹參新酮(4-methylenemiltirone)，見表2，這些可能為黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的有效成分。靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因排前10位的為PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AB1、ADRB2、NCOA1、SCN5A、HTR、CHRM1、RXRA，見表3，將映射所得的161個(gè)靶點(diǎn)利用String作PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3，上面所得到的前10個(gè)靶點(diǎn)均包含在主要靶點(diǎn)內(nèi)，表明這些基因可能為黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的關(guān)鍵基因。

圖2 “黃甲軟肝顆粒C(成分)-T(靶點(diǎn))”網(wǎng)絡(luò)

圖3 “成分-靶點(diǎn) PPI”網(wǎng)絡(luò)

表2 黃甲軟肝顆粒靶點(diǎn)數(shù)排名前10位成分信息

表3 靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因的前10位

2.4 GO功能富集分析

采用 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行 GO 富集分析。GO 是為了統(tǒng)一表征所有物種的基因及基因產(chǎn)物的性質(zhì)而發(fā)起的生物信息學(xué)計(jì)劃，旨在建立一套適用于所用物種的、對(duì)基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述并能隨著研究不斷深入而更新的語(yǔ)義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。GO 有 3 個(gè)分類：(1)分子功能，描述基因產(chǎn)物在分子生物學(xué)上的活性；(2)生物學(xué)過(guò)程，指由分子功能有序組成的，具有多個(gè)步驟的過(guò)程；(3)細(xì)胞組分，指基因產(chǎn)物位于何種細(xì)胞器或基因產(chǎn)物組中，表明基因產(chǎn)物在什么地方起作用。通過(guò)根據(jù)顯著性程度P<0.05(P值由小到大)，GO 分析共包含 960條富集結(jié)果，其中生物過(guò)程相關(guān)的條目最多，有845個(gè)，主要涉及細(xì)胞凋亡的調(diào)控、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、NF-κB通路調(diào)控、MAPK通路調(diào)控、激活蛋白激酶活性、調(diào)節(jié)白介素12的產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫球蛋白的分泌、調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶活性等。通過(guò)文獻(xiàn)查詢，選出與之相關(guān)性較多的，通過(guò)Omicshare對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見圖4。

圖4 GO功能富集分析圖

2.5 KEGG分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行通路富集分析。在 DAVID 的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，選擇基因名稱對(duì)應(yīng)的基因標(biāo)示符“ OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；為所提交的基因列表選擇對(duì)應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，背景也選擇“Homo Sapiens”，即以人類全基因組為背景基因和參照集合，獲得通路富集結(jié)果。對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，共獲得 87條富集結(jié)果。根據(jù)顯著性程度P<0.05(P值由小到大)，篩選出69條通路在肝纖維化方面具有作用。其中前20條通路為乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌、TNF信號(hào)通路、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、恰加斯病(美國(guó)錐蟲病)、破骨細(xì)胞分化、慢性粒細(xì)胞白血病、Toll樣受體信號(hào)通路、弓形蟲病、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、甲型流感、丙型肝炎、百日咳、膠質(zhì)瘤、HTLV-Ⅰ感染、NOD樣受體信號(hào)通路、結(jié)核。其結(jié)果見圖5。其中，Y 軸代表通路名稱，X 軸代表基因數(shù)(count，即目標(biāo)基因中屬于這個(gè)通路的基因的數(shù)量)，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。在69條通路中近期研究新型熱點(diǎn)通路包括ErbB信號(hào)通路、胞質(zhì)DNA傳感途徑、Rap1信號(hào)通路等。

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證

2.6.1 大鼠體重與肝臟指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束末，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，給藥組中水飛薊素組和黃甲軟肝中、高劑量組體重增加，且高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，水飛薊素組、黃甲軟肝顆粒各劑量組的肝臟指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明黃甲軟肝顆粒具有很好的改善肝臟指數(shù)作用(見圖6)。

圖6 黃甲軟肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響(n=6)

2.6.2 黃甲軟肝顆粒對(duì)大鼠肝功能的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT和AST活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，水飛薊素組和黃甲軟肝顆粒各劑量組大鼠血清中ALT和AST的水平顯著降低(P<0.05)，提示黃甲軟肝顆粒具有改善大鼠肝功能的作用，見圖7。

圖7 黃甲軟肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠血清中ALT和AST的影響 (n=6)

2.6.3 大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 正常大鼠肝臟組織切片顯示肝中央靜脈及周圍肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。在CCl4處理的大鼠中，觀察到氣泡性變異增多、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維狀等變化，證明肝纖維化建立成功。而黃甲軟肝組和水飛薊素組可有效緩解病變，氣泡性變異明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示給藥組肝纖維化呈現(xiàn)很好的好轉(zhuǎn)，見圖8。

圖8 黃甲軟肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理的影響

3 討 論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討了黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的作用網(wǎng)絡(luò)與潛在機(jī)制，研究顯示，黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的可能關(guān)鍵成分10個(gè)，為槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-O-methylisomucronulatol、甾醇、二氫丹參內(nèi)酯、丹參酮IIA、刺芒柄花素、糖甙、4-亞甲丹參新酮，關(guān)鍵靶點(diǎn)10個(gè)，為PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AB1、ADRB2、NCOA1、SCN5A、HTR、CHRM1、RXRA，GO與KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，主要通路為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、MAPK活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、ErbB信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、胞質(zhì)DNA傳感途徑、Rap1信號(hào)通路等。

肝纖維化是肝組織抗損傷的修復(fù)過(guò)程，早期對(duì)肝組織的損傷修復(fù)有重要的防御作用。因此，在肝纖維化發(fā)生的早期階段，此時(shí)以病因治療及抗炎保肝治療為主，進(jìn)展期和顯著肝纖維化期以及肝硬化期時(shí)需要進(jìn)行抗肝纖維化治療。慢性炎癥反應(yīng)是纖維化形成的前提及進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)力，抑制肝臟炎癥、肝細(xì)胞保護(hù)和抗氧化是抗肝纖維化的重要措施[10- 11]。 從圖1中可以發(fā)現(xiàn)黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化中包括IL- 1β、IL- 6、IL- 2、 TNF、IL- 4、IL- 10、PTGS1、PTGS2等因子，這些都是在炎癥中起到主要作用的炎癥細(xì)胞因子，說(shuō)明炎癥與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

目前，肝活檢組織病理學(xué)檢查是肝纖維化診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[12]，血清中 AST和ALT可以反映肝細(xì)胞的損傷情況，兩者比值與肝纖維化程度、肝功能損傷之間密切相關(guān)[13]，而肝臟指數(shù)可作為大體確定肝臟病變程度的參考[14]。本次體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過(guò)肝臟指數(shù)、血清中ALT和AST指標(biāo)、肝組織病理學(xué)比較，水飛薊素組和黃甲軟肝顆粒各劑量組對(duì)肝纖維化均有一定的改善作用。

在本階段，我們通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化進(jìn)行了系統(tǒng)分析，初步揭示了黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證，黃甲軟肝顆?？筛纳艭Cl4致肝纖維化大鼠的體重、肝臟指數(shù)和血清生化指標(biāo)，減輕大鼠肝病理?yè)p傷，說(shuō)明黃甲軟肝顆粒對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有很好的保護(hù)作用。我們后續(xù)將系統(tǒng)地進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其功效，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。