ABCC2基因過表達(dá)對(duì)肺腺癌預(yù)后的影響

方子晗 喻祖豪 劉 穎 楊 振 王 可

1 湖北文理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室(襄陽 441053)

2 湖北文理學(xué)院臨床循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心(襄陽 441053)

3 廣州市第一人民醫(yī)院(廣州 510180)

肺癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，且其對(duì)人類生命安全的威脅正在逐漸升高[1- 2]。雖然目前肺癌的診療手段有所改善，但肺癌病人的預(yù)后情況仍不太理想，其五年生存率不足30%[3]。因此，尋找肺癌相關(guān)個(gè)體化生物標(biāo)志物，對(duì)肺癌的靶向治療及預(yù)后狀況改善具有十分重要的作用。相關(guān)結(jié)論表明，基因調(diào)控在肺癌的發(fā)展進(jìn)程中至關(guān)重要[4- 5]。ABCC2(ATP binding cassette subfamily C member 2)編碼蛋白作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的重要構(gòu)成部分，可通過細(xì)胞膜外和細(xì)胞膜內(nèi)運(yùn)輸各種分子[6- 7]。研究顯示ABCC2基因異常表達(dá)可參與多藥耐藥，與多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性顯著相關(guān)[8- 9]。但目前關(guān)于ABCC2與肺癌預(yù)后之間相關(guān)性研究較少，且作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)中的肺腺癌數(shù)據(jù)，分析ABCC2的基因表達(dá)情況，評(píng)估ABCC2在肺腺癌病人中的表達(dá)情況及其與病人預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)性。同時(shí)進(jìn)行基因集富集分析，確定肺腺癌中與ABCC2調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路，初步探討ABCC2對(duì)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 TCGA

肺腺癌病人信息來自于TCGA數(shù)據(jù)庫(截至2021年12月)，均從官網(wǎng)獲得(https://portal.gdc.cancer.gov/)。數(shù)據(jù)下載格式為TPM，類型為RNA測(cè)序數(shù)據(jù)(RNAseq)和肺腺癌病人臨床數(shù)據(jù)，包括ABCC2 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，肺腺癌病人年齡、性別、種族、吸煙史、臨床病理特征、隨訪結(jié)局等變量信息。經(jīng)過初步數(shù)據(jù)清洗和合并，共有535例肺腺癌病人含有RNA測(cè)序數(shù)據(jù)及基本臨床數(shù)據(jù)，57例肺腺癌病人同時(shí)具有癌組織和癌旁組織RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.2 HPA數(shù)據(jù)庫

采用人類蛋白質(zhì)圖譜(human protein atlas，HPA)數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)分析肺腺癌病人中ABCC2的蛋白水平情況[10]。選取數(shù)據(jù)庫中正常肺組織和肺腺癌病人腫瘤組織的免疫組化結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，要求選取對(duì)象的性別相同，年齡相近，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)時(shí)抗體型號(hào)一致。

1.3 基因功能富集性分析

基因富集分析(gene-set enrichment analysis，GSEA)用于評(píng)估并確定肺腺癌中與ABCC2調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路[11]。GSEA通過基因在癌組織和癌旁組織中表達(dá)的差異程度對(duì)基因進(jìn)行排序，從而評(píng)估基因集是否能夠進(jìn)行富集。為探討ABCC2過表達(dá)影響肺腺癌病人疾病發(fā)展的潛在生物學(xué)機(jī)制，將在腫瘤組織和癌旁組織中顯著差異性表達(dá)基因設(shè)定為基因集，進(jìn)一步以ABCC2作為表型標(biāo)記基因，通過c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt進(jìn)行富集分析。標(biāo)準(zhǔn)化處理后P< 0.05的基因集定義為顯著富集。GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用于相關(guān)基因集的富集性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié) 果

2.1 肺腺癌病人基本臨床特征

TCGA數(shù)據(jù)庫中共有535例肺腺癌病人同時(shí)含有RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床信息，基本描述見表1。肺腺癌病人中年齡大于65歲占總?cè)藬?shù)的50.6%，女性占比46.5%。病理分期為Ⅰ期的病人共294例，占比55.8%。T1期病人共175例(32.9%)，M0期病人共361例(93.5%)，N0期病人共348例(67.1%)。有吸煙史的肺腺癌病人共446例(85.6%)。隨訪結(jié)束時(shí)共有343例存活(64.1%)，192例死亡(35.9%)，平均生存時(shí)間為22.30(13.93±37.53)月。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌病人基本信息n=535，n(%)

臨床變量結(jié)果生存狀態(tài)存活343 (64.1)死亡192 (35.9)

2.2 ABCC2在腫瘤中的表達(dá)情況

采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析ABCC2在泛癌中的表達(dá)結(jié)果見圖1A。ABCC2的表達(dá)水平在多個(gè)不同種類腫瘤的癌組織和癌旁組織中具有顯著性差異，如膀胱癌、乳腺癌、肺鱗癌、肺腺癌等。其中，ABCC2在肺腺癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平情況見圖1。圖1B和圖1C顯示，ABCC2在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織(均P<0.05)。在535例癌組織和非配對(duì)59例癌旁組織中，ABCC2的表達(dá)水平存在差異(1.44±1.91 vs 0.46±0.21，P<0.001)；同時(shí)，關(guān)于ABCC2在57例肺腺癌病人癌組織和配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)水平結(jié)果顯示出相同結(jié)果(1.35±1.89 vs 0.46±0.21，P=0.002)。

圖1D和圖1E展示了HPA數(shù)據(jù)庫中通過免疫組化技術(shù)對(duì)ABCC2在正常肺組織和肺腺癌組織中的蛋白表達(dá)檢測(cè)水平。結(jié)果顯示，ABCC2在腫瘤組織中的蛋白水平高于正常肺組織。

圖1 ABCC2在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況

2.3 ABCC2高低表達(dá)組的差異表達(dá)基因

通過ABCC2 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)(0.65)將肺腺癌人群分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，對(duì)其他基因進(jìn)行差異性分析。見圖2A(火山圖)，以校正后P<0.05且|log2fold change|>1.5作為顯著性差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，在高表達(dá)組和低表達(dá)組中共有3 542個(gè)基因差異表達(dá)，其中3 522個(gè)基因上調(diào)，下調(diào)基因共20個(gè)。其中fold change值最大的前10個(gè)基因分別為RNU5B-1、RNU5A-1、SNORA49、RNY1、RN7SKP255、G6PC、SNORA54、RNU2- 23P、AKR1C4、SNORA74A，其與ABCC2共表達(dá)熱圖見圖2B。ABCC2相關(guān)差異表達(dá)基因的功能富集性分析結(jié)果顯示，ABCC2及共表達(dá)基因參與細(xì)胞代謝、化學(xué)致癌過程、藥物代謝等生物過程，提示ABCC2可能對(duì)相關(guān)物質(zhì)代謝產(chǎn)生一定的影響(圖2C和圖2D)。

2.4 ABCC2基因表達(dá)與肺腺癌病人預(yù)后情況之間的關(guān)聯(lián)性

采用差異性分析方法研究ABCC2基因表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果見圖3。ABCC2的基因表達(dá)水平在不同病理分期及T、M、N分級(jí)情況下有差異(P均<0.001)。

圖3 ABCC2基因表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

采用COX回歸評(píng)估ABCC2 mRNA表達(dá)水平與肺腺癌病人預(yù)后情況之間的關(guān)聯(lián)性。圖4 Kaplan-Meier生存分析曲線展示了TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌病人腫瘤組織中ABCC2基因表達(dá)水平的中位數(shù)(0.65)為分界點(diǎn)，將人群分為高低表達(dá)組并分析ABCC2不同表達(dá)水平與肺腺癌病人預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。COX回歸結(jié)果顯示HR(95%CI)值為1.46 (95%CI: 1.09～1.95,P=0.010)，提示ABCC2高表達(dá)與肺腺癌病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。ABCC2在不同特征肺腺癌人群中的Kaplan-Meier生存分析曲線結(jié)果見圖5，也表現(xiàn)出相似的結(jié)果。

圖4 Kaplan-Meier分析ABCC2過表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性

圖5 ABCC2與肺腺癌病人預(yù)后的亞組分析

進(jìn)一步在相關(guān)臨床變量中篩選與肺腺癌病人總生存期相關(guān)的變量，結(jié)果見表2。單因素分析結(jié)果顯示(圖6)，與肺腺癌病人生存相關(guān)的臨床變量為病理分期(P<0.001)、T分期(P=0.002)、M分期(P=0.006)、N分期(P<0.001)及ABCC2(P=0.010)。進(jìn)一步將P<0.05的相關(guān)變量進(jìn)行多因素分析，其中病理分期(HR: 1.73,95%CI: 1.12～2.67;P=0.013)、T分期(HR: 1.69,95%CI: 1.08～2.64;P=0.021)、N分期(HR: 2.04,95%CI: 1.39～2.99;P<0.001)及ABCC2(HR: 1.53,95%CI: 1.10～2.13;P=0.011)為與肺腺癌病人預(yù)后有顯著性關(guān)聯(lián)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 單因素和多因素分析ABCC2表達(dá)與肺腺癌預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)性

圖6 ABCC2基因表達(dá)與肺腺癌預(yù)后分析森林圖

2.5 GSEA鑒定ABCC2相關(guān)信號(hào)通路

通過對(duì)ABCC2高低表達(dá)組數(shù)據(jù)集采取GSEA分析，以識(shí)別肺腺癌中與ABCC2調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路。GSEA分析采用MSigDB數(shù)據(jù)集(c2.cp.kegg.v 7.0.symbols.gmt)進(jìn)行，每次分析進(jìn)行 1 000次基因集排列。與ABCC2高表達(dá)表型相關(guān)的差異富集通路定義為標(biāo)準(zhǔn)化處理后P< 0.05的信號(hào)通路，相關(guān)分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，drug metabolism other enzymes、PID/HNF3B pathway、porphyrin and chlorophyll metabolism、metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、pentose and glucuronate interconversions、WP glucuronidation、starch and sucrose metabolism、ascorbate and aldarate metabolism、reactome glucuronidation信號(hào)通路在ABCC2高表達(dá)表型中差異富集(圖7)。

表3 GSEA分析肺腺癌中與ABCC2調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路

圖7 GSEA分析與ABCC2顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路

3 討 論

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫探討ABCC2基因過表達(dá)于肺腺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。差異性分析顯示ABCC2在肺腺癌腫瘤組織中存在過表達(dá)現(xiàn)象，且在不同臨床病理特征分組情況下具有顯著性差異。生存分析結(jié)果表明ABCC2過表達(dá)使肺腺癌病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。單因素及多因素回歸結(jié)果證實(shí)ABCC2過表達(dá)是肺腺癌病人不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，本研究采用GSEA方法探討肺腺癌中與ABCC2顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路，為探討ABCC2對(duì)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用的生物學(xué)機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

研究表明，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體)相關(guān)分子的高表達(dá)是造成腫瘤耐藥性的重要原因之一[12-13]。其中，ABCC2經(jīng)證實(shí)是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的重要分子之一，與腫瘤化療藥物耐藥有關(guān)，并由此可調(diào)控腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[14]。Buchler M等人于1996年在大鼠肝臟中首次發(fā)現(xiàn)ABCC2的異常表達(dá)情況[15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，ABCC2基因在多種人體腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)的現(xiàn)象，如肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等[16-18]。此外，ABCC2在腫瘤中表現(xiàn)出的遺傳多態(tài)性，是導(dǎo)致其調(diào)控腫瘤細(xì)胞重要蛋白編碼及表達(dá)的重要原因之一[19]。Lotte KV等[20]研究發(fā)現(xiàn)ABCC2在結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織中mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常組織，且ABCC2高表達(dá)組病人的術(shù)后化療效果較差。本次研究發(fā)現(xiàn)ABCC2在肺腺癌腫瘤組織中過表達(dá)，且ABCC2過表達(dá)可導(dǎo)致肺腺癌病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。以上研究結(jié)果均提示ABCC2過表達(dá)可能影響肺腺癌的發(fā)展進(jìn)程，可能是肺腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。

為進(jìn)一步探討ABCC2過表達(dá)在肺腺癌發(fā)展過程中的作用，本研究通過GSEA對(duì)肺腺癌中與ABCC2調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示藥物代謝、能量代謝等信號(hào)通路與ABCC2過表達(dá)顯著相關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體可激活A(yù)TP酶并提前水解ATP，將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，從而影響細(xì)胞內(nèi)藥物吸收，使胞內(nèi)藥物未能達(dá)到有效工作濃度，進(jìn)而影響藥物療效[21- 24]。Korita PV等[14]研究發(fā)現(xiàn)肝癌病人中ABCC2過表達(dá)可影響順鉑類藥物對(duì)肝細(xì)胞性肝癌化療的效果。Sun L等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中相關(guān)基因可通過誘導(dǎo)ABCC2過表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生[25]。Zhang D等[26]研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌中相關(guān)lncRNA可通過調(diào)控ABCC2的mRNA表達(dá)水平，從而影響順鉑類藥物的化療效果。ABCC2過表達(dá)在其他腫瘤中也表現(xiàn)出類似的藥物耐藥作用[27- 30]。結(jié)合本次GSEA分析結(jié)果，提示ABCC2可能通過影響肺腺癌靶向藥物的代謝過程，從而影響肺腺癌的發(fā)展進(jìn)程，對(duì)肺腺癌病人的預(yù)后產(chǎn)生一定的影響。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析ABCC2與肺腺癌預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)ABCC2基因過表達(dá)使肺腺癌病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，ABCC2過表達(dá)可能是肺腺癌預(yù)后狀況評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。ABCC2可能通過影響肺腺癌靶向藥物的代謝，從而對(duì)肺腺癌的發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。