桃核承氣湯化瘀瀉熱“性-效”相關物質(zhì)基礎研究Δ

舒萬芬，劉文，宋信莉，劉興德，張甘純，秦琴，王洪鑫（.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴陽 55005；.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 55005）

中藥藥性理論是中藥的核心理論之一，也是中醫(yī)藥研究的基礎[1]。藥性的“四氣”“五味”是中醫(yī)藥理論對人體生物效應的總體概括和對藥物功能屬性的抽象描述，可通過“組分-機體狀態(tài)-效應”表征[2]。歷代醫(yī)家都遵循中藥藥性理論來指導臨床遣方用藥，“寒者熱之，熱者寒之，辛以散之，苦則瀉之”理論是中醫(yī)臨床辨證論治的重要依據(jù)。隨著研究思路的創(chuàng)新和研究方法的進步，越來越多的學者基于中藥藥性“可拆分、可組合”的思想[3]，利用現(xiàn)代技術對中藥成分進行拆分和解析以明確其藥性屬性[4―5]，但由于缺少藥效學指標與藥性的關聯(lián)性分析，因此尚無法揭示發(fā)揮生物效應的物質(zhì)與中藥藥性功效之間的關系。

桃核承氣湯出自漢代張仲景的《傷寒論》，由大黃、芒硝、桃仁、桂枝、甘草5味中藥組成，主治瘀熱互結于下焦之蓄血證，為現(xiàn)代中醫(yī)臨床常用的活血化瘀經(jīng)典方劑。本研究基于中藥藥性“可拆分、可組合”的思想，以經(jīng)典名方桃核承氣湯為例，將中藥復方按其單味藥藥性進行拆分組合，通過藥效學指標來表征其藥性相關生物效應；隨后，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatographyquadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive-MS）法對優(yōu)勢藥性組成分進行鑒定，并借助AutoDock工具進行分子對接，對中藥復方“性-效”相關物質(zhì)基礎進行分析，為中藥藥性理論的現(xiàn)代研究提供新思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Sysmex CS5100-2型全自動凝血分析儀（希森美康生物科技有限公司）、Multshan Sky型多功能酶標儀（新加坡Life Technologies公司）、BSC-250型恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、Q ExactiveTM型UPLC-Q-Exactive-MS儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Pannoramic 250型數(shù)字切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

大黃、桃仁、桂枝、甘草、芒硝飲片（批號分別為20121401、20200108、201001、200801、191201）均購自北京同仁堂貴陽藥店有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院孫慶文教授鑒定均為真品，且符合2020年版《中國藥典》（一部）的相關要求[6]。

脂多糖（LPS）原料藥（批號408Z036，純度≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor ne‐crosis factor-α，TNF-α）、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）、內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）試劑盒（貨號分別為ZC-37624、ZC-36085、ZC-37024）均購自上海茁彩生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號20220317）購自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

本實驗使用SPF級雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量為（220±10）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2020-0001。所有大鼠均被飼養(yǎng)于約25 ℃且通風良好的飼養(yǎng)間內(nèi)，自由攝食、飲水。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，進行后續(xù)實驗（取材前禁食、不禁水24 h）。實驗方案遵循貴州中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 基于蓄血證模型的動物實驗

2.1.1 分組與造模 將54只大鼠隨機分為空白組、模型組、全方組、苦寒組、辛溫組、甘平組，每組9只。除空白組外，其余各組大鼠遵循Shwartzman反應原理，按2.5 mL/kg的劑量，以尾靜脈注射LPS溶液（以生理鹽水為溶劑，質(zhì)量濃度為20 mg/L）2次（間隔24 h）的方式復制蓄血證大鼠模型[7―8]。

2.1.2 給藥 根據(jù)2020年版《中國藥典》（一部）中各單味藥的藥性[6]，對桃核承氣湯進行藥性拆分，將大黃和芒硝歸為苦寒組，將甘草歸為甘平組，將桂枝歸為辛溫組。參閱古代醫(yī)籍，《千金食治》曰桃仁“味苦甘辛無毒”，《本草通玄》載桃仁“甘辛微溫”，《日華子本草》提出桃仁性“熱”，《黃帝內(nèi)經(jīng)》云“治寒以熱，治熱以寒，桃仁為活血化瘀藥，用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊……血得溫則行，得寒則凝?！笨梢姡湃苏J為桃仁的藥性為溫熱性。結合2020年版《中國藥典》（一部）內(nèi)容和桃仁的現(xiàn)代藥理作用研究[6，9―10]，本研究將桃仁歸為辛溫組。

本課題組通過前期研究得桃核承氣湯的物質(zhì)基準處方量為17.29 g/kg（大黃-芒硝-桃仁-桂枝-甘草質(zhì)量比為4∶2∶1∶2∶2）[11]。遵循“經(jīng)典名方基于原方”的原則，根據(jù)其物質(zhì)基準的制備方法，按上述質(zhì)量比稱取大黃、芒硝、桃仁、桂枝、甘草飲片細粉，加12倍量水回流提取1 h×3次，低溫減壓濃縮至適當濃度后冷凍干燥（每1 g全方組、苦寒組、辛溫組、甘平組干燥物分別相當于生藥總量0.48、0.51、0.23、0.50 g）。灌胃前，用水稀釋，制成相應灌胃藥液。各藥物組大鼠灌胃相應藥液（全方組、苦寒組、辛溫組、甘平組的給藥劑量分別為17.29、9.43、4.71、3.14 g/kg，均以生藥量計；劑量按物質(zhì)基準的臨床劑量換算），空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg。各組大鼠均預干預7 d，再分別于第1次造模前2 h、第1次造模后12 h、第2次造模前2 h、第2次造模后0.5 h灌胃相應藥液或生理鹽水。

2.1.3 肝組織病理觀察 為了檢驗模型是否建立成功（即肝細胞形態(tài)結構是否完整正常、靜脈內(nèi)皮細胞是否完整、有無炎癥細胞浸潤或壞死、肝竇有無明顯擴張、是否瘀血等[12]），取造模后各組大鼠的肝組織（空白組大鼠取相同部位肝組織）適量，以生理鹽水洗滌后用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)修剪、脫水、包埋、切片，以蘇木精-伊紅（HE）染色，封片后進行鏡檢，觀察其肝組織病理變化。

結果（圖1）顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠肝組織門管區(qū)及肝竇可見輕微的炎癥細胞浸潤，并可見局部門管區(qū)輕微擴張和淋巴細胞或中性粒細胞聚集，提示該組大鼠肝組織微血管處于反應性紊亂失調(diào)狀態(tài)，蓄血證模型建立成功。與模型組比較，除甘平組外，其余各藥物組大鼠肝組織上述病理學異常均有一定程度改善，具體表現(xiàn)為淋巴細胞或中性粒細胞聚集減少，局部門管區(qū)擴張不明顯或無擴張。

2.1.4 凝血指標檢測 根據(jù)文獻報道，各項凝血、炎癥指標在第2次注射LPS后2 h左右到達峰值[13]?；诖?，本研究于第2次注射LPS 2 h后，深度麻醉大鼠（每組隨機選6只），于其腹主動脈取血4 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，分離上層血漿，采用固定法以全自動凝血分析儀檢測凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶原活動度（prothrombin activity，PTA）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thrombin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、凝血酶時間（thrombin time，TT）。同時，在同一時間點于大鼠腹主動脈取血5 mL，置于普通采血管中，分離上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法以全自動酶標儀于450 nm波長下檢測血清ET-1含量。上述實驗均嚴格按相應試劑盒說明書操作。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05（統(tǒng)計學方法下同）。

結果（表1）顯示，與空白組比較，模型組大鼠PT、ET-1含量均顯著延長或升高（P＜0.01），PTA、APTT、FIB、TT均顯著縮短或降低（P＜0.01）。與模型組比較，全方組、苦寒組、辛溫組大鼠PT和全方組、辛溫組、甘平組大鼠ET-1含量均顯著縮短或降低（P＜0.05或P＜0.01）；全方組、苦寒組、辛溫組大鼠PTA，全方組、辛溫組大鼠APTT，以及各藥物組大鼠FIB、TT均顯著延長或升高（P＜0.05或P＜0.01）?？梢?，全方組和辛溫組大鼠各凝血指標均顯著改善，提示全方發(fā)揮抗凝化瘀作用可能與方中辛溫藥材的相關程度最高。

表1 桃核承氣湯及其藥性拆分成分對模型大鼠凝血指標的影響（x±s，n＝6）

2.1.5 炎癥指標檢測 在“2.1.4”項下同一時間點于大鼠腹主動脈取血5 mL，置于普通采血管中，分離上層血清，采用ELISA法以全自動酶標儀于450 nm波長下檢測各組大鼠血清中CRP、TNF-α含量和SOD抑制率。上述實驗均嚴格按相應試劑盒說明書操作。

結果（表2）顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清CRP、TNF-α含量均顯著增高（P＜0.01），SOD抑制率顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，全方組和苦寒組大鼠血清CRP、TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD抑制率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；此外，甘平組大鼠TNF-α含量和SOD抑制率也均有顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。可見，該方的抗炎瀉熱作用主要來源于方中的苦寒藥材。

表2 桃核承氣湯及其藥性拆分成分對模型大鼠炎癥指標的影響（x±s，n＝6）

2.1.6 凝血、炎癥指標分析 利用SIMCA-P軟件對凝血、炎癥指標數(shù)據(jù)進行標準化處理，隨后以空白組和模型組為基準，以藥性拆分組與基準組之間的距離為主要因素，以藥性拆分組圖形離散程度為次要因素，進行離散度趨勢分布分析和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。結果見圖2、圖3。基于越接近空白組、越遠離模型組則該組的性質(zhì)越趨于空白組的原則，可得出各給藥組的化瘀藥效依次為全方組＞辛溫組＞苦寒組＞甘平組，瀉熱藥效依次為全方組＞苦寒組＞甘平組＞辛溫組，即辛溫組的抗凝作用較好，苦寒組的抗炎作用較好，兩者為優(yōu)勢藥性組。

2.2 優(yōu)勢藥性組的成分鑒定

2.2.1 供試品溶液的制備 根據(jù)藥性拆分組的生物效應研究結果，取優(yōu)勢藥性組（辛溫組、苦寒組）各單味藥細粉，按“2.1.2”項下方法制備相應提取物。取上述提取物各1 g，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成相應供試品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.2 色譜條件 以 ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（B）-乙腈（C）為流動相進行梯度洗脫（0～20.0 min，5%C→40%C，20.0～33.0 min，40%C→90%C；33.0～35.0 min，90%C；35.0～35.1 min，90%C→5%C；35.1～40.0 min，5%C）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）進行正、負離子模式切換掃描；鞘氣為氮氣，流速為10.5 L/min；輔助氣為氮氣，流速為3.0 L/min；毛細管溫度為550 ℃；噴霧電壓為3.5 kV；離子掃描范圍為m/z120～1 000。

2.2.4 成分鑒定 取“2.2.1”項下各供試品溶液適量，按“2.2.2”“2.2.3”項下條件進行 UPLC-Q-Exactive-MS分析，得總離子流圖（圖略）。利用Xcalibur軟件在質(zhì)量偏差＜5 ppm的范圍內(nèi)提取各成分的元素組成并進行一級、二級質(zhì)譜解析，通過參考相關文獻[14―18]，從辛溫組樣品圖譜中共鑒定出32個活性成分，包括木蘭花堿、羥基酪醇、脫落酸、苦杏仁苷、草夾竹桃苷、白果內(nèi)酯、球腺糖苷A、甘草苷、對羥基肉桂酸、原花青素B1、原兒茶酸、右旋奎寧酸、二氫槲皮素等；從苦寒組樣品圖譜中共鑒定出35個化學成分，包括7-甲氧基-4-甲基香豆素、蘆薈大黃素、黃芩素、香豆素、紫花前胡醇、去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、大黃素、大黃素甲醚、尼泊金乙、松柏醛、刺芒柄花素、黃豆黃素、羥基芫花素、淫羊藿素、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、原兒茶醛等。

2.3 靶點獲取與分子對接

2.3.1 “化瘀”和“瀉熱”相關靶點的獲取 為使所獲靶點能與“2.1”項下藥效學研究結果互證，本研究以“pro‐thrombin”“thrombin”“fibrinogen”“endothelin-1”“C reac‐tive protein”“tumor necrosis factor-α”“superoxide dis‐mutase”為關鍵詞，在 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uni‐prot.org/）中檢索與凝血指標（PT、PTA、APTT、FIB、TT、ET-1）、炎癥指標（CRP、TNF-α、SOD）密切相關的蛋白，并在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中篩選出與上述藥效指標相對應的基因，隨后選取該基因的低分辨率構象作為對接受體。按上述方法篩選，共得到凝血指標相關靶點6個，分別為F2（PT）、F9（PTA）、F11（TT）、AT3（TT）、FGA（FIB）、EDN1（ET-1），構象分別為5NHU、3KCG、7MBO、2B5T、1FZD、1T7H；共得到炎癥相關靶點5個，分別為CRP（CRP）、LITAF（TNF-α）、TNF（TNF-α）、SOD1（SOD）、SOD2（SOD），構象分別為3PVN、AF-Q99732-F1-model-v2、2E7A、2XJK、1PL4。

2.3.2 活性化合物的準備及分子對接 以“2.2.4”項下鑒定出的辛溫組、苦寒組藥材成分為目標成分，將其CAS號輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmsp-e.com）和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetpredic‐tion.ch/），以口服生物利用度≥30%為標準[19]，分別從辛溫組、苦寒組藥材成分中篩選出可作為對接配體的成分13、17個。

利用Pymol軟件獲取“2.3.1”項下受體的對接口袋信息，使用AutoDock Vina軟件進行對接并使用TBtools軟件和Pymol軟件繪制對接結果熱圖。結果（圖4）顯示，配體與受體結合較好（即結合能≤－5.0 kcal/mol，1 kcal＝4.186 kJ）[20]的辛溫組成分有10個，苦寒組成分有13個。

使用Pymol軟件繪制出對接結合能最小的“成分-靶點”空間構象。以辛溫組藥材成分脫落酸（圖5A）為例，其與凝血指標相關靶點FGA活性位點（1FZD構象）的氨基酸殘基PHE-769之間存在疏水作用，與氨基酸殘基TRY-816、GLU-782、ASN-667之間存在氫鍵。以苦寒組藥材成分黃芩素（圖5B）為例，其與炎癥指標相關靶點CRP活性位點（3PVN構象）的氨基酸殘基RPO-206之間存在π-π共軛，與氨基酸殘基TRP-205、GLN-203之間存在氫鍵。

3 討論

《傷寒論》中將外邪入血稱作蓄血證，其病機一則為瘀，二則為熱，是太陽表邪不解，邪氣入里化熱，繼而由各種原因引起的瘀血與邪熱互結的臨床證候的統(tǒng)稱。目前，研究者多采用細菌或細菌內(nèi)毒素（如LPS，屬于中醫(yī)的熱邪、毒邪）干預的方法來復制蓄血證動物模型。研究表明，蓄血證與凝血功能、炎癥反應密切相關，故這兩項指標的檢測是蓄血證診斷的重要依據(jù)[21]。

本研究復制了瘀熱互結的蓄血證大鼠模型，病理觀察結果顯示，模型組大鼠肝組織表現(xiàn)出局部血液凝集的瘀熱互結現(xiàn)象。給予桃核承氣湯及其藥性拆分成分干預后，全方組和辛溫組大鼠的凝血指標（PT、PTA、APTT、FIB、TT、ET-1）全部得到明顯改善，全方組和苦寒組大鼠炎癥因子（CRP、TNF-α、SOD）的釋放得到明顯抑制；結合離散度趨勢分布分析和PLS-DA結果發(fā)現(xiàn)，該方化瘀的物質(zhì)基礎來自辛溫組藥材，瀉熱的物質(zhì)基礎來自苦寒組藥材，即辛溫組、苦寒組為優(yōu)勢藥性組。

有研究指出，辛溫之性藥材可溫經(jīng)通脈以助化瘀，能使血液流變學及血流動力學異常得以改善，是化瘀作用的表現(xiàn)；苦寒之性藥材大多為疏下之藥，既能清除里熱，又能下瘀，使熱隨大便而出，是瀉熱效應的表現(xiàn)[22―23]。為進一步明確辛溫組化瘀和苦寒組瀉熱的物質(zhì)基礎，本研究采用UPLC-Q-Exactive MS技術從辛溫組中鑒定出32個化合物，從苦寒組中鑒定出35個化合物。隨后，利用分子對接技術，最終篩選出結合能≤－5.0 kcal/mol的辛溫組成分10個（脫落酸、羥基酪醇、原花青素B1等）、苦寒組成分13個（黃芩素、蘆薈大黃素、去甲蟛蜞菊內(nèi)酯等），提示上述成分分別為兩組“性-效”相關的關鍵物質(zhì)。

筆者在研究中還發(fā)現(xiàn)，甘平組藥物也顯示出僅次于苦寒組的抗炎瀉熱效應。中醫(yī)認為，平性藥是藥性平和、作用力和緩、功效及應用范圍比較廣泛的一類藥物；現(xiàn)代研究認為，該類藥物含有黃酮類、萜類、甾體類、糖類等成分，具有“雙向適用，條件顯性”的藥性特點[24]。但本研究僅結合藥效學結果對優(yōu)勢藥性組的成分進行了分析，并未考慮甘平組藥材，也未考慮全方共煎的成分變化，故有待后續(xù)研究予以完善，以進行更深層次的藥性與藥效物質(zhì)基礎研究。