糖蛋白的異常糖基化在前列腺癌中的研究進展

劉家舟，潘家驊，薛 蔚

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院泌尿科，上海 200127)

前列腺癌是全球男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]。前列腺癌的明確診斷依賴于有創(chuàng)的前列腺穿刺活檢，前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen, PSA)檢測的臨床應(yīng)用有效提高了前列腺癌的早期篩查率，但其作為無創(chuàng)診斷標(biāo)志物的臨床價值低[2]。目前，臨床上仍缺乏能夠有效鑒別前列腺癌與良性前列腺疾病，或反映前列腺癌治療效果、預(yù)測前列腺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

糖基化是生物體內(nèi)最常見的翻譯后修飾。糖組學(xué)與糖生物學(xué)的發(fā)展使人們進一步認(rèn)識到糖類物質(zhì)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[3]，異常糖基化參與腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等過程[4]?，F(xiàn)有臨床應(yīng)用中的腫瘤標(biāo)志物絕大部分為糖蛋白，其表面異常聚糖修飾具有臨床意義[5-6]，因此，腫瘤發(fā)生發(fā)展中糖蛋白的異常糖基化受到廣泛關(guān)注。糖蛋白中聚糖部分與蛋白質(zhì)部分的連接有兩種方式，根據(jù)連接方式的不同可將糖蛋白聚糖分為N-連接型聚糖和O-連接型聚糖。前者指與蛋白質(zhì)分子中天冬酰胺殘基的酰胺氮相連的糖鏈，后者指與蛋白質(zhì)分子中絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連的糖鏈[3]，細(xì)胞中糖蛋白糖基化過程在高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生，由各類糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶催化調(diào)控[7]。

前列腺是男性生殖器中最大的附屬性腺，屬于人體外分泌腺，其生理功能包括分泌富含糖蛋白的前列腺液參與生殖代謝。因此，前列腺惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能通過前列腺組織中或體液如前列腺液、尿液、血液中糖蛋白的異常糖基化反映，使聚糖成為反映前列腺疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物。對此，全球研究者進行了大量探索，揭示前列腺癌中PSA的異常糖基化、糖蛋白的核心巖藻糖基化、唾液酸化、β-N-乙酰葡糖胺單糖基修飾等糖基化修飾的變化。本文對糖蛋白糖基化在前列腺癌中的研究進展進行綜述，總結(jié)糖蛋白異常糖基化在前列腺癌生物標(biāo)志物方面的應(yīng)用前景。

1 PSA的異常糖基化

PSA是由前列腺上皮分泌的一種絲氨酸蛋白酶，臨床上被廣泛用于前列腺惡性腫瘤的篩查[2]。然而，PSA作為前列腺惡性腫瘤的診斷指標(biāo)，具有特異性低且預(yù)后價值有限的特點[8]。血清PSA的檢測無法有效區(qū)分前列腺惡性腫瘤與良性前列腺病變，導(dǎo)致大量不必要的有創(chuàng)檢查及過度治療[9]。因此，不少研究者致力于探究PSA的糖基化特點，意圖發(fā)現(xiàn)具有前列腺癌特異性的糖型結(jié)構(gòu)，找尋比血清PSA更可靠的診斷試驗。

PSA是一種含有237個氨基酸的單鏈糖蛋白，在第69位的天冬酰胺殘基上有一處N-糖基化位點[10]。PERACAULA等[11]利用質(zhì)譜分析法比較來自正常受試者精液和LNCaP前列腺癌細(xì)胞系純化得到的PSA糖基化表征，發(fā)現(xiàn)來自LNCaP細(xì)胞系的PSA聚糖含有更多的的巖藻糖和N-乙酰半乳糖胺，以及更少的唾液酸。此后，有大量的研究運用不同方法比較了良惡性前列腺疾病患者體液中的PSA糖基化表征[11-20]。TAJIRI等[17]解析了前列腺癌患者血清及精液中PSA的N聚糖圖譜，指出前列腺癌患者血清中PSA的N聚糖修飾富含巖藻糖基化的雙天線寡糖，其中大部分含有α-2,3連接的唾液酸。FUKUSHIMA等[14]利用凝集素親和層析法發(fā)現(xiàn)相較于良性前列腺增生患者，前列腺癌患者血清中的PSA具有更多的α-1,2-巖藻糖基和β-N-乙酰半乳糖胺。為了探尋高度惡性前列腺癌的診斷指標(biāo)，F(xiàn)UJITA等[13]利用凝集素抗體酶聯(lián)免疫吸附法測定69例前列腺穿刺患者尿液中的具有核心型巖藻糖基化修飾的PSA，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者尿液中核心巖藻糖基化的PSA含量顯著降低，以此指標(biāo)進行診斷試驗，診斷Gleason評分≥7分的前列腺癌，曲線下面積達到0.72，高于血清或尿液PSA的診斷效能。LLOP等[18]提取了44例不同危險分度的前列腺癌患者與29例良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia， BPH)患者的血清PSA，提出利用酶聯(lián)凝集素試驗與凝集素親和試驗的方法，可以定量血清PSA的核心巖藻糖基化及α-2,3唾液酸化。前者在高危前列腺癌中顯著降低，診斷高危前列腺癌的靈敏度達90%，特異度達95%；后者在高危前列腺癌中顯著增高，靈敏度85.7%，特異度95.5%。

多項研究結(jié)果表明PSA的糖基化分析在前列腺癌的診斷及分期方面具有良好的應(yīng)用前景。但上述研究仍有樣本量較小及糖鏈解構(gòu)不完全的不足，其診斷效能有待進一步驗證。

2 核心巖藻糖基化

核心巖藻糖基化指巖藻糖殘基通過共價鍵α-1,6連接至N聚糖的核心N-乙酰葡糖胺的過程，在肺癌、乳腺癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化的增加[21]。研究者利用高效液相色譜或質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)在前列腺癌患者血清總糖蛋白中，相較于健康人群及良性前列腺增生患者，N聚糖的核心巖藻糖基化顯著增加[22-23]。

核心巖藻糖基化的過程由α-1,6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase 8, FUT8)催化。WANG等[24]通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)FUT8的表達在轉(zhuǎn)移性前列腺癌及高Gleason評分前列腺癌組織中顯著上升，且在LNCaP細(xì)胞系中，F(xiàn)UT8的過表達顯著提高了前列腺癌細(xì)胞的遷移能力。H?TI等[25]的研究發(fā)現(xiàn)FUT8的表達在去勢抵抗性前列腺癌LAPC4細(xì)胞系中有更進一步上調(diào)，且FUT8的過表達降低了前列腺癌細(xì)胞PSA的分泌，進而提出FUT8的上調(diào)可能與前列腺癌去勢抵抗的發(fā)生有關(guān)。上述研究提示核心巖藻糖基化具有潛力成為診斷性生物標(biāo)志物，但其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍需進一步探索。

3 唾液酸化

唾液酸化是指唾液酸殘基通過共價鍵連接至聚糖末端。異常唾液酸化可能與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[21]。在前列腺癌患者中，血清總糖蛋白唾液酸化水平有顯著程度的上升[26-27]。其中MICHALAKIS等[27]的前瞻性研究納入70例具有下尿路癥狀的患者行前列腺穿刺活檢，血清唾液酸水平在該人群中診斷前列腺癌可達到86%的靈敏度和84%的特異度。ZHANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)血清唾液酸水平是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素。前列腺癌患者血清總N聚糖中α-2,3唾液酸水平相較于良性前列腺增生患者顯著上升[22]。

唾液酸化Tn抗原(sialyl-Tn, sTn)是一類被截短的O聚糖，由1個唾液酸殘基通過共價鍵α-1,6連接于N-乙酰半乳糖胺形成。sTn的出現(xiàn)提示腫瘤組織中不完全糖基化的發(fā)生，并與多種癌癥的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)[28]。sTn的形成由α-N乙酰半乳糖胺-α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6 N-Acetylgalactosaminide Alpha-2,6-Sialyltransferase 1, ST6GalNAc1)催化。前列腺癌細(xì)胞中，ST6GalNAc1的轉(zhuǎn)錄由雄激素受體通路介導(dǎo)，其表達調(diào)控sTn的合成，具有降低細(xì)胞粘附的作用[29]。在膀胱癌患者中sTn作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面生物標(biāo)志物的潛力正在被進一步探索[30-31]，但在前列腺癌中sTn的預(yù)測作用尚無報道。

唾液酸化Lewis抗原(Sialyl Lewis X, SLeX)也是一類腫瘤相關(guān)的血型抗原寡糖鏈，具有末端唾液酸化及遠(yuǎn)端巖藻糖基化修飾的特點，位于糖蛋白聚糖鏈末端[32]。SLeX作為選擇素配體，介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞與E-選擇素的結(jié)合，增強腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[33-34]。在前列腺癌患者中，SLeX的上調(diào)提示了不良預(yù)后[35]。在前列腺癌組織中核心-2-N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(core 2 β-1, 6-N-acetylglucosaminyl-transferase-1, GCNT1)的表達上升，進而顯著上調(diào)了O連接型SLeX在PSA、PAP、MUC1等糖蛋白聚糖中的合成[36]，這也提示SLeX具有成為前列腺癌糖蛋白靶標(biāo)的潛力。

4 β-N-乙酰葡糖胺單糖基修飾

β-N-乙酰葡糖胺單糖基修飾(O-GlcNAcylation)指β-N-乙酰葡糖胺以共價鍵結(jié)合于糖蛋白絲氨酸或蘇氨酸殘基上。不同于N聚糖或O聚糖修飾，這種糖基化修飾是在O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)催化下，發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的可逆性過程[37]。β-N-乙酰葡糖胺單糖基修飾在多種癌癥的發(fā)展中起重要作用，與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)[37]。在前列腺癌中，GU等[38]發(fā)現(xiàn)前列腺組織中β-N-乙酰葡糖胺單糖基修飾顯著增加，并具有誘導(dǎo)BPH細(xì)胞向癌細(xì)胞惡變的能力。KAMIGAITO等[39]提出前列腺穿刺組織中β-N-乙酰葡糖胺單糖修飾的上調(diào)提示不良預(yù)后。于此對應(yīng)的是，ITKONEN等[40]對1 987例前列腺癌患者組織進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)OGT蛋白水平上調(diào)與腫瘤Gleason評分、TN分期及患者生化復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。

5 體液N聚糖組學(xué)檢測

前列腺癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著異常糖基化的廣泛發(fā)生，前列腺癌患者尿液、血清等體液是腫瘤的無創(chuàng)診斷甚至預(yù)后判斷的重要材料，而體液中糖蛋白的糖組學(xué)分析為無創(chuàng)檢測提供了進一步支持。N聚糖可被肽-N-聚糖酶F/A(peptide-N-glycanase F/A, PNGaseF/A)自核心N-乙酰葡糖胺處與蛋白質(zhì)部分完整游離，但尚無聚糖酶能準(zhǔn)確分離O聚糖，因此，N聚糖組學(xué)檢測在前列腺癌的應(yīng)用更為成熟?；谕馇刑擒彰感蜇炏治鯷41]，多個研究利用不同來源的體液，通過不同高通量N聚糖分析方法建立了前列腺癌的N聚糖圖譜[22, 42-50]。

SALDOVA等[22]利用高效液相色譜法分析了13例BPH與34例前列腺癌患者的血清總N聚糖圖譜，提出前列腺癌患者血清中核心巖藻糖基化的雙天線聚糖和α-2,3唾液酸顯著增加，基于其N聚糖圖譜建立的診斷模型效能高于傳統(tǒng)血清PSA。KAWAHARA等[43]提出一種基于液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，提取前列腺癌和BPH患者各5例的尿液游離糖蛋白，建立了尿糖蛋白組學(xué)圖譜，其中基于N聚糖譜建立的診斷模型曲線下面積達到1。VERMASSEN等[44-45]通過基于DNA測序儀的熒光糖電泳(DNA sequencing equipment-fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis, DSA-FACE)分析54例健康人、93例BPH及74例前列腺癌患者尿液N聚糖，建立了尿液糖組學(xué)標(biāo)志物模型：未巖藻糖基化的雙天線、三天線、四天線糖鏈總量與三天線糖鏈含量的比值，可為血清PSA提供附加的診斷價值，在PSA灰區(qū)(PSA=4～10 ng/mL)具有突出的診斷效能。ISHIBASHI等[46]利用多糖印跡法結(jié)合飛行時間質(zhì)譜分析了共計738例健康人、BPH患者及不同分期前列腺癌患者的血清N聚糖圖譜，發(fā)現(xiàn)去勢抵抗性前列腺癌患者血清中三天線與四天線N聚糖顯著上升，并基于此發(fā)現(xiàn)成功預(yù)測1例ADT治療中的前列腺癌患者進入去勢抵抗階段。MATSUMOTO等[42]利用類似分析方法，通過9種N聚糖鏈的定量組合建立了CRPC的N聚糖評分，在共計693例血清樣本中，判斷CRPC的敏感度為87%，特異度為69%，且對患者的預(yù)后具有獨立預(yù)測作用。

基于體液的無創(chuàng)檢測因個體異質(zhì)性往往不能達到令人滿意的診斷效能，上述研究中利用血清及尿液的N聚糖組學(xué)分析在回顧性研究中展現(xiàn)了其成為無創(chuàng)診斷標(biāo)記物的潛力，但診斷價值有待大樣本前瞻性研究驗證，判斷患者分期及預(yù)后的臨床意義仍待挖掘。

6 總結(jié)與展望

大量新興研究的結(jié)果表明前列腺癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著糖蛋白異常糖基化的發(fā)生，這些糖基化模式的變化在體外細(xì)胞系、組織樣本及體液樣本中均有發(fā)現(xiàn)。其中核心巖藻糖基化上調(diào)、唾液酸化增加等異常糖基化在多種惡性腫瘤中均有報道[21]，前列腺癌中糖蛋白的異常糖基化是否能成為特異性標(biāo)志物，其變化是否由前列腺癌特異性的通路介導(dǎo)仍有待探索。催化sTn抗原合成的糖基轉(zhuǎn)移酶ST6GalNAc1是雄激素受體通路的直接轉(zhuǎn)錄目標(biāo)[29]。參與β-N-乙酰葡糖胺單糖基修飾的己糖胺生物合成途徑被發(fā)現(xiàn)由雄激素受體通路調(diào)控[40]。MUNKLEY等[51]通過RNA測序發(fā)現(xiàn)一組催化異常糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶受外源性雄激素刺激顯著上調(diào)。以上研究結(jié)果表明前列腺癌中糖蛋白的異常糖基化可能部分由雄激素受體通路介導(dǎo)，但仍需進一步探究。

糖組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白組學(xué)后的新興研究領(lǐng)域。聚糖分子具有多變的鍵連接方式和分支方式，同樣的蛋白質(zhì)因糖鏈的結(jié)合位置、糖基數(shù)目、糖基序列不同可產(chǎn)生的不同分子形式，且從基因組信息無法有效預(yù)測最終的聚糖結(jié)構(gòu)，因此蛋白質(zhì)組學(xué)大多數(shù)方法不適用糖組學(xué)研究，聚糖結(jié)構(gòu)分析因存在技術(shù)困難而進展相對緩慢。近年來，基于質(zhì)譜、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等建立的高通量聚糖鑒定技術(shù)的開展為糖組學(xué)的進一步深入奠定了基礎(chǔ)，利用體外細(xì)胞系、組織標(biāo)本、體液等樣本可建立糖蛋白糖基化圖譜，從而反映腫瘤中糖蛋白的糖組學(xué)變化。然而，現(xiàn)有技術(shù)普遍存在預(yù)處理復(fù)雜、樣本需求量高、經(jīng)費較高等不足，尚未能將研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為易于檢測且臨床價值高的臨床生物標(biāo)志物。

基于體液的生物標(biāo)志物在多種惡性腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用，體液中糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)具有成為新標(biāo)志物的巨大潛力[52]。在前列腺癌患者的體液中，前列腺液作為前列腺的直接分泌物包含著最豐富的前列腺相關(guān)糖蛋白信息。經(jīng)肛門前列腺按摩后，前列腺液可通過尿道排出并被采集，該操作為泌尿外科常規(guī)無創(chuàng)檢查。基于前列腺液的蛋白組學(xué)研究成果提示前列腺液或前列腺按摩后尿液中糖蛋白表征對前列腺疾病具有檢測價值[53]，但前列腺液具有糖蛋白含量不穩(wěn)定、無法標(biāo)準(zhǔn)化取樣、質(zhì)控難以把握的缺點。聚糖分析方面，NYALWIDHE等[48]采集了高危前列腺癌、低危前列腺癌、無前列腺癌3組各10例患者的前列腺液，建立3組樣本池，通過飛行時間質(zhì)譜法解析其中N聚糖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高危前列腺癌患者前列腺液中三天線、四天線聚糖含量降低，平分型N乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)升高，得出前列腺液N聚糖表征可反映前列腺疾病狀態(tài)。但該研究混合了不同患者前列腺液進行檢測，其結(jié)果有待進一步驗證。前列腺液中糖蛋白的異常糖基化有待新的研究進行解析。

本文揭示了前列腺癌中糖蛋白的異常糖基化伴隨著糖基轉(zhuǎn)移酶的異常表達廣泛存在，其具有協(xié)助診斷、預(yù)測分期、判斷預(yù)后的臨床應(yīng)用潛力，糖組學(xué)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化值得期待，而異常糖基化的功能信息、調(diào)控機制有待未來新的研究者深入探索。