Ras基因及蛋白與甲狀腺癌的關(guān)系

付云平，葉暉

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550001; 2．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺外科，貴陽 550001)

甲狀腺癌為內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，從組織病理方面可分為由上皮細(xì)胞來源的乳頭狀甲狀腺癌和濾泡狀甲狀腺癌，以及由濾泡旁C細(xì)胞發(fā)生的甲狀腺髓樣癌和具有高度侵襲性的甲狀腺未分化癌，且在我國每年將以20%的速度持續(xù)增長，2020年居全球女性腫瘤發(fā)病率第5位[1-4]，其高發(fā)病率與術(shù)前分子診斷技術(shù)的提高有著密不可分的關(guān)系[5]，其中大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus，Ras)基因是甲狀腺癌中的常見突變基因，僅次于v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源體B1(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因[6]，多見于甲狀腺濾泡狀癌，在甲狀腺乳頭狀癌也有發(fā)現(xiàn)，且多見于濾泡亞型的甲狀腺乳頭狀癌中[7]。Ras基因的常見位點(diǎn)突變多見于密碼子12、13和61，異常的持續(xù)激活使編碼形成RAS蛋白后激活促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路[8]。這些通路參與了細(xì)胞膜受體酪氨酸激酶信號向細(xì)胞核的傳播，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程。但Ras基因在甲狀腺癌中的作用機(jī)制尚不清楚。Ras基因研究結(jié)果可為甲狀腺癌的診斷及風(fēng)險評估提供參考，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)及分子研究奠定基礎(chǔ)[9]。現(xiàn)對Ras基因及蛋白與甲狀腺癌的關(guān)系予以綜述。

1 Ras基因的發(fā)現(xiàn)

Ras突變最先由Harvey[10]在白血病小鼠中發(fā)現(xiàn)，將含有常規(guī)傳代莫羅尼白血病病毒的小鼠血漿注射到15只新生的BALB/c小鼠體內(nèi)，第32天發(fā)現(xiàn)存活的6只小鼠中有5只在注射部位或注射部位附近長出肉瘤，從而發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化基因Ras。隨后，Kirsten和Mayer[11]、Peters等[12]、Rasheed等[13]分別在1967年、1974年、1978年發(fā)現(xiàn)另外3種反轉(zhuǎn)錄病毒中也有Ras基因突變。Ras基因突變的亞型不同，分別以Harvey和Kirsten兩人名字區(qū)分不同亞型的Ras突變，即H-Ras和K-Ras。1983年，Hall等[14]在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了另一種從未在反轉(zhuǎn)錄病毒中發(fā)現(xiàn)的Ras突變，命名為N-Ras。至此人們發(fā)現(xiàn)了Ras基因突變的3種常見亞型。

1.1Ras基因的結(jié)構(gòu)及功能 Ras基因主要存在于真核生物，其包括3種不同的類型，其中N-Ras位于第1號染色體上(1p22～p32),而H-Ras與K-Ras分別位于第11號染色體(11p15.1～p15.3)上和第12號染色體(12p1.1)上。3種亞型的Ras基因均具有5個外顯子，但其中1個不參與編碼蛋白。K-Ras基因由于第4外顯子變異的不同分為K-RasA和K-RasB[15]，最終編碼后的蛋白表達(dá)為一種高度相關(guān)的由189個氨基酸殘基組成的分子量為21的G蛋白單體，也稱為p21 Ras蛋白或RAS蛋白,Ras基因?qū)⒕幋a的p21的序列都平均分配在 4個外顯子上[16]。

不同亞型Ras基因在腫瘤中表達(dá)大不相同，根據(jù)癌癥體細(xì)胞突變目錄數(shù)據(jù)庫報道，K-Ras是所有癌癥中最常見的突變亞型，在結(jié)直腸癌中占主導(dǎo)，而在甲狀腺癌中并不同，N-Ras表達(dá)高于H-Ras和K-Ras，為甲狀腺癌中最常見的突變亞型，其突變的位點(diǎn)主要發(fā)生在密碼子12、13和61。同樣，不同亞型的Ras癌基因的常見突變位點(diǎn)也不相同，K-Ras突變位點(diǎn)主要是密碼子12和13，N-Ras大多突變位于密碼子61，低概率在密碼子12和13[17]。H-Ras在密碼子12的突變率最高，其次是密碼子61和13。另外，學(xué)者也發(fā)現(xiàn)影響Ras基因其他位點(diǎn)的突變，但頻率很低[18]。因此，這3個密碼子占人類癌癥所有Ras突變的92%～98%。

1.2RAS蛋白的結(jié)構(gòu)及功能 RAS蛋白是一種由Ras原癌基因編碼而成的含有189個氨基酸，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)與鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)結(jié)合的球蛋白，分子量為21,按照蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，從N′端開始，可分為1-85(SH1)、86-165(SH2)、166-185(SH3)、186-189(SH4)4個結(jié)構(gòu)域。

其中SH1、SH2結(jié)構(gòu)域氨基酸基本相同，高度保守，稱為G區(qū)[19]，主要通過與GTP/鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合來調(diào)控信號通路，當(dāng)RAS蛋白與GTP結(jié)合時處于激活狀態(tài)，而與GDP結(jié)合時處于非激活態(tài)[20]，兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換依靠Ras-GTP酶活化蛋白和Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的調(diào)節(jié)，Ras-GTP酶活化蛋白的作用為水解GTP,將RAS蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榕cGDP結(jié)合的無效狀態(tài)，與之相反，RasGEFs的作用是使RAS蛋白處于激活狀態(tài)[21]。RAS蛋白作為分子開關(guān)，通過與GTP/GDP間的結(jié)合轉(zhuǎn)變充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，控制著下游信號通路[22]。

而SH3、SH4結(jié)構(gòu)域處于高度可變區(qū)域，在SH4結(jié)構(gòu)域的C端(186-189)中含有一個CAAX終端盒子,其中C代表半胱氨酸,A代表脂肪氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、升壓素),X代表任意氨基酸，其通過C端的CAAX終端盒子與類脂結(jié)合后將RAS蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，從而引發(fā)下游通路的激活，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

1.3Ras作用通路

1.3.1Ras/Raf/MAPK激酶(MAPK kinase，MEK)/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路 目前，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路為Ras基因最明確的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)受到膜外有絲分裂原刺激后，可導(dǎo)致一些整合素的持續(xù)上調(diào)，使RAS蛋白的SH2區(qū)與細(xì)胞膜表面的受體型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)作用，進(jìn)一步通過SH3結(jié)構(gòu)域與GEFs作用結(jié)合Ras-GTP，激活Ras[23-24]?；罨癄顟B(tài)的RAS蛋白刺激下游的信號因子，發(fā)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，其中Raf蛋白激酶(ARAF、BRAF和CRF)是主要的RAS蛋白效應(yīng)器，活化的Raf通過磷酸化MEK上的絲氨酸殘基將其激活,MEK再激活ERK,進(jìn)而磷酸化與胞質(zhì)和胞膜相連的底物，磷酸化的ERK被激活后快速地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而使腫瘤促進(jìn)因子上調(diào)[8，25],如血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、血小板反應(yīng)蛋白1，誘導(dǎo)細(xì)胞從DNA合成前期(G1期)進(jìn)入DNA合成期(S期)，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖。

1.3.2PI3K-Akt通路 細(xì)胞外信號激活細(xì)胞膜上的RTK，從而導(dǎo)致RAS激活，隨后使PI3K激活，激活后的PI3K催化4，5-二磷酸肌醇轉(zhuǎn)變?yōu)?，4，5-三磷酸肌醇，3，4，5-三磷酸肌醇使磷酸肌醇依賴蛋白激酶1磷酸化后被激活，從而激活A(yù)kt,磷酸化的Akt是Akt的一種活化形式，進(jìn)入細(xì)胞核可誘導(dǎo)腫瘤促進(jìn)因子水平的上調(diào)[26]；在細(xì)胞質(zhì)中，活化的Akt還可激活其他信號分子或通路，其中突出的為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路[27]，通過促進(jìn)翻譯在腫瘤發(fā)生中起重要意義；另外，活化的Akt還能直接使糖原合成酶激酶-3β磷酸化使其失活。正常情況下，糖原合成酶激酶-3β的作用為抑制β-蛋白，當(dāng)激活的Akt使糖原合成酶激酶-3β失活后，緩解了其對β-蛋白的負(fù)向作用，導(dǎo)致更多的β-蛋白進(jìn)入核內(nèi)促進(jìn)促腫瘤基因的表達(dá)。另外，激活的Akt進(jìn)入核內(nèi)可使叉頭框蛋白O3(forkhead box O3，F(xiàn)oxO3)磷酸化，磷酸化的FoxO3從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，與14-3-3蛋白結(jié)合后存留在胞質(zhì)中，從而終止FoxO3通路的促凋亡活性[28]。磷酸化的Akt通過以上3種途徑對甲狀腺腫瘤的發(fā)生提供了強(qiáng)大的動力。

通過以上途徑，Ras基因的突變誘導(dǎo)了大多數(shù)腫瘤的發(fā)生，尤其是在結(jié)直腸癌、皮膚癌等腫瘤中，在結(jié)直腸癌中以K-Ras多見，而在皮膚癌則以N-Ras多見，不管是何種亞型的突變，這些機(jī)制的核心都是Ras基因出現(xiàn)了點(diǎn)突變，導(dǎo)致MAPK涉及廣泛的二級分子改變，亦或是使Akt磷酸化激活后發(fā)生核位置的改變，而兩者之間協(xié)同和放大了致癌活性，從而介導(dǎo)了甲狀腺腫瘤發(fā)生。

2 Ras基因與甲狀腺

1988年，Lemoine等[29]首次在甲狀腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)3種Ras癌基因(N-Ras/K-Ras/H-Ras)的激活突變，從而開始了Ras基因在甲狀腺癌中的科學(xué)研究。研究表明，Ras基因突變是甲狀腺癌中僅次于BRAF突變的常見突變[30]，主要發(fā)生在30%～45%的濾泡狀甲狀腺癌中，少數(shù)乳頭狀甲狀腺癌中也尚有表達(dá)，但僅見于濾泡型甲狀腺乳頭狀癌，約10%，而在經(jīng)典型甲狀腺癌中幾乎不表達(dá)[31]。

2.1Ras基因在甲狀腺結(jié)節(jié)中的診斷作用 甲狀腺癌的臨床治療通常從甲狀腺結(jié)節(jié)的評估開始，最常見的檢測方式為超聲檢測。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、醫(yī)學(xué)設(shè)備的不斷完善，高分辨率超聲的出現(xiàn)對甲狀腺結(jié)節(jié)的檢測率得到了大幅度的提高，而超聲引導(dǎo)下細(xì)針抽吸活檢技術(shù)進(jìn)一步提高了甲狀腺癌的準(zhǔn)確度及特異度，但仍有部分結(jié)節(jié)不能明確診斷性質(zhì)，對這類具有中度惡性風(fēng)險的結(jié)節(jié)采納何種治療方案，目前仍是個難題。為解決這一難題，多項(xiàng)指南均提出對診斷不明確的甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行基因檢測，因此分子分型的研究為甲狀腺癌的診斷、治療和預(yù)后評估帶來了新的契機(jī)[32]。在過去的10年中，人們做出了極大的努力，將Ras突變作為診斷分子標(biāo)記應(yīng)用于細(xì)針抽吸活檢，特別是針對細(xì)胞學(xué)不確定的結(jié)節(jié)，發(fā)現(xiàn)Ras突變對甲狀腺癌的靈敏度和特異度較BRAF低，除在濾泡型甲狀腺癌、濾泡型甲狀腺乳頭狀癌及髓樣癌中有突變外，有20%～25%的良性甲狀腺濾泡性腺瘤中也發(fā)生Ras突變。Nabhan等[30]通過對多篇文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)性回顧及Meta分析后發(fā)現(xiàn)，不管是對何種類型的Ras突變進(jìn)行檢測均不能對術(shù)前診斷不明確的結(jié)節(jié)提出有效的臨床管理方法，甚至需要進(jìn)一步的再次行基因檢測或細(xì)針抽吸活檢。而Ras突變作為甲狀腺癌中的第二常見突變，仍是目前基因研究的重點(diǎn)，對Ras突變應(yīng)用于甲狀腺癌診斷現(xiàn)多是將其與其他分子標(biāo)記，特別是遺傳標(biāo)記[BRAF、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、PI3K等]結(jié)合使用。Rossi等[33]、Decaussin-Petrucci等[34]表示分子檢測用于不確定的甲狀腺細(xì)胞穿刺組織中，可增加診斷敏感性，且對不確定的甲狀腺細(xì)針抽吸活檢標(biāo)本進(jìn)行輔助分子檢測的應(yīng)用為患者提供了更好的分層和分類。另一項(xiàng)單中心研究對1 056個不確定細(xì)胞學(xué)的連續(xù)甲狀腺細(xì)針抽吸活檢樣本進(jìn)行前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)多基因檢測試劑盒對非典型性不確定意義/不確定意義的濾泡性病變和濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤的結(jié)節(jié)診斷靈敏度分別達(dá)到了88%、87%。因此，多基因檢測能更準(zhǔn)確地對診斷不明確的結(jié)節(jié)進(jìn)行評估[35]。目前，細(xì)針抽吸活檢是術(shù)前對甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)進(jìn)行評估的首選檢查，但其仍存在一定的局限性，對于活檢穿刺后意義不明確的非典型病變或?yàn)V泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤的結(jié)節(jié)，若進(jìn)一步行BRAF、Ras、TERT等分子檢測，可為臨床醫(yī)師提供更多的臨床證據(jù)，對指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后均具有重要價值。而Ras突變是基因診斷的一個重要組成部分，更有助于提高不同類型甲狀腺癌的診斷敏感性，尤其是對具有乳頭樣核特征的非侵襲性甲狀腺濾泡性腫瘤[36]，期待隨著對Ras基因的深入研究，可使含有Ras突變的基因盒劑的診斷效率得到證實(shí)和進(jìn)一步提高。

2.2Ras基因突變對甲狀腺癌的影響 Ras基因是甲狀腺癌中僅次于BRAF基因突變的常見突變，其分子改變主要發(fā)生于第12、13、和61密碼子,其中以N-Ras基因61密碼子突變最常見[37]。突變后的Ras基因使編碼產(chǎn)生的RAS蛋白持續(xù)處于活化狀態(tài)?；罨蚏AS蛋白能夠同時激活MAPK和PI3K/Akt兩個信號通路，刺激細(xì)胞生長、增殖和分化阻礙細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

目前認(rèn)為，Ras基因是濾泡型甲狀腺癌和濾泡型甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生的早期事件，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Mehrzad等[38]認(rèn)為，N-Ras基因突變與甲狀腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移及不良生存率有關(guān)；Chen等[39]也提出，K-Ras突變是甲狀腺癌生存不良的獨(dú)立預(yù)測因素，且表示Ras基因分型可能在識別與預(yù)后不良相關(guān)的甲狀腺亞群方面發(fā)揮作用。盡管有研究表示，Ras基因突變可能與更差的預(yù)后和腫瘤轉(zhuǎn)移傾向相關(guān)[38]，但Ras基因的預(yù)后價值也不十分明確。另有學(xué)者認(rèn)為，Ras基因突變的甲狀腺癌往往并不具備很強(qiáng)的侵襲性[40]。Insilla等[41]通過對145例分化良好的甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行TERT、BRAF、Ras檢測發(fā)現(xiàn)，Ras突變在分化型甲狀腺乳頭狀癌患者的侵襲性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床特征方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Kakarmath等[42]也認(rèn)為,伴有Ras基因突變的甲狀腺癌超聲特征最常表現(xiàn)為陰性特征,在細(xì)胞學(xué)上也更多地提示與低風(fēng)險和“不確定”的特征相關(guān)，從而疏忽甲狀腺結(jié)節(jié)的惡性程度。由此可見，Ras致癌基因的突變雖然增加了腫瘤形成的風(fēng)險，但具有Ras陽性的這類甲狀腺癌并不屬于高侵襲性腫瘤，可在適當(dāng)?shù)呐R床條件下采取相對保守的治療措施。另有部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ras基因與BRAF或TERT共突變時，甲狀腺癌具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織侵犯、復(fù)發(fā)及惡性風(fēng)險，使低風(fēng)險惡性結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)變?yōu)楦唢L(fēng)險惡性結(jié)節(jié)[43-44]。Shen等[45]則更進(jìn)一步指出，BRAF V600E/Ras突變共存和單獨(dú)TERT突變的情況下患者預(yù)后最差；BRAF V600E和TERT突變患者情況居中；Ras單獨(dú)突變和野生型患者預(yù)后最好。

綜上所述，目前Ras基因?qū)谞钕侔┑挠绊懮袩o統(tǒng)一定論，需要進(jìn)行更多的科學(xué)研究論證，Ras基因單獨(dú)突變時，由于其在不同類型甲狀腺癌臨床結(jié)局中的不確定作用，如何恰當(dāng)?shù)厥褂盟鼈儊韰f(xié)助評估和治療甲狀腺癌尚未明確。但當(dāng)Ras與BRAF、TERT共突變時，甲狀腺癌周圍組織侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險均增大，所以，術(shù)前行多基因聯(lián)合檢測可為甲狀腺結(jié)節(jié)的惡性程度評估及治療方案選擇提供幫助。

3 Ras基因突變的分子靶向治療

目前甲狀腺癌的首選治療方式為手術(shù)治療，術(shù)后行促甲狀腺激素內(nèi)分泌抑制治療，通過抑制促甲狀腺激素降低對甲狀腺的刺激，從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)；對于惡性程度高，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移可能性大的甲狀腺惡性腫瘤，還可術(shù)后行131I放射性治療，但對于難治性碘抵抗、低分化及未分化甲狀腺癌，由于攝碘能力較低，故131I放射性治療的效果并不理想，且早期轉(zhuǎn)移、周圍組織侵犯及術(shù)后復(fù)發(fā)的發(fā)生風(fēng)險更高。因此，基因靶向治療的重要性顯得尤為突出，這也符合目前全球提出的精準(zhǔn)醫(yī)療的概念。

對于Ras突變型甲狀腺癌而言，Ras基因的產(chǎn)物-RAS蛋白通過對GTP的結(jié)合持續(xù)活化，進(jìn)一步誘發(fā)MAPK通路和PI3K通路一系列的級聯(lián)反應(yīng)。因此，針對Ras突變的分子治療，主要包括與Ras通路有關(guān)的Raf激酶、MEK、ERK的研究以及對RAS蛋白的研究。其中索拉菲尼是一種靶向作用于血管內(nèi)皮生長因子受體2、3、轉(zhuǎn)染重排的RTK抑制劑,其通過作用于Raf-MEK-ERK通路后，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。美國食品藥品管理局早在2013年已批準(zhǔn)索拉菲尼為晚期甲狀腺癌、放射性碘抵抗甲狀腺癌的進(jìn)展期首選藥物[46]，2017年國家食品藥品監(jiān)督管理總局也批準(zhǔn)了索拉菲尼用于治療難治性分化型甲狀腺癌。一篇有關(guān)索拉菲尼對分化型甲狀腺癌、髓樣癌及未分化癌療效的回顧性研究顯示,其對甲狀腺腫瘤的緩解率和穩(wěn)定率分別為21%和60%[47]。

RTK抑制劑侖伐替尼可以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體的激酶活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長，從而延緩病情的進(jìn)展，為腫瘤的晚期挽救治療提供了治療方案。MEK抑制劑SL327與RTK抑制劑舒尼替尼在抑制甲狀腺癌細(xì)胞活力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、減弱細(xì)胞侵襲性等方面具有顯著協(xié)同作用[48]。

4 小 結(jié)

Ras基因突變是甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要原癌基因之一。主要通過MAPK通路及PI3K通路誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展；也可通過抑制凋亡通路加速細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，尤其是在濾泡型甲狀腺癌中，Ras基因的表達(dá)率較高，且當(dāng)Ras基因與BRAF或TERT基因共突變時，甲狀腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及侵犯周圍的風(fēng)險增高，這可幫助一線臨床醫(yī)師提供有效的風(fēng)險評估和合理的治療方案。腫瘤患者的Ras陽性仍是現(xiàn)今腫瘤治療的一大難題，但靶向Raf/MEK/ERK已取得重大進(jìn)展。針對Ras突變的腫瘤治療能更有效地降低化療藥物的毒性，提高療效，但目前其作用機(jī)制及對甲狀腺癌細(xì)胞的影響仍然處于探索階段，后期研究仍須進(jìn)一步闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制,為腫瘤的早期診斷及分子靶向治療提供可靠依據(jù)。