NVP-BEZ235調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞DNA輻射損傷修復(fù)作用研究進(jìn)展

孫婉君 張 恒 王 輝

放射治療是治療惡性腫瘤的重要手段之一，但輻射抵抗依舊是困擾腫瘤科醫(yī)生的難題。在對(duì)放射生物學(xué)的探索中，Withers于1975年提出臨床放射生物學(xué)中的“4R”理論，即：細(xì)胞放射損傷修復(fù)(repair)、細(xì)胞周期再分布(reassortment)、氧效應(yīng)及缺氧細(xì)胞再氧合(reoxygenation)和細(xì)胞再群體化(repopulation)。在此基礎(chǔ)上，Steel于1989年提出第5“R”，即放射敏感度(radiosensitivity)。多項(xiàng)研究著眼于調(diào)節(jié)以上不同途徑，以期增加腫瘤細(xì)胞的輻射損傷。PI3K/Akt/mTOR通路是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的經(jīng)典信號(hào)通路，經(jīng)電離輻射誘導(dǎo)，該通路異常激活，可通過促進(jìn)DNA損傷修復(fù)等機(jī)制，表達(dá)輻射抗性。NVP-BEZ235是一種PI3K、mTOR雙重抑制劑，多項(xiàng)體外/異種移植瘤研究已證明NVP-BEZ235可特異性阻斷PI3K/Akt/mTOR通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)途徑，增加腫瘤細(xì)胞的輻射損傷。

一、NVP-BEZ235抑制PI3K/Akt/mTOR通路

根據(jù)放射生物學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，治療劑量的高能X射線通過在細(xì)胞內(nèi)激發(fā)活性氧，造成對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的持續(xù)損傷，其中DNA雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)是最致命的DNA損傷類型，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、衰老或失去增殖能力[1]。細(xì)胞為保持基因組的穩(wěn)定性，進(jìn)化出一套有效的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制——DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)，包括細(xì)胞周期檢查點(diǎn)阻滯和DNA損傷修復(fù)，對(duì)DSB進(jìn)行有效修復(fù)，避免細(xì)胞凋亡。其中修復(fù)方式主要有兩種，即非同源末端結(jié)合修復(fù)(non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重組修復(fù)(homologous recombination，HR)，這也是目前認(rèn)為導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞輻射抵抗的重要原因之一[2]。

PI3K/Akt/mTOR通路在諸多基本細(xì)胞過程中起中心作用，與多條通路存在交互作用，電離輻射誘導(dǎo)后活化異常，多項(xiàng)研究證明，參與激活下游細(xì)胞周期蛋白和DNA修復(fù)途徑蛋白，啟動(dòng)DDR途徑，是腫瘤細(xì)胞表達(dá)輻射抗性的主要機(jī)制[3]。該通路活化，由雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTOR complex 1，mTORC1)介導(dǎo)磷酸化下游真核起始因子4E結(jié)合蛋白1[eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF-4E)-binding protein 1，4E-BP1]和核糖體蛋白質(zhì)S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)，使其分別與eIF-4E和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF-3)解離，促進(jìn)翻譯起始復(fù)合物的形成。S6K1磷酸化eIF-4B和核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6，S6)，啟動(dòng)翻譯，并磷酸化真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF-2K)，使翻譯延長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1介導(dǎo)合成的蛋白主要參與調(diào)控細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、DNA 損傷修復(fù)過程[4]。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR通路可以減少DNA損傷修復(fù)相關(guān)原料生成，間接抑制細(xì)胞的自我修復(fù)。

目前已發(fā)現(xiàn)多種PI3K和mTOR抑制劑，其中NVP-BEZ235是咪唑喹啉類化合物，一種強(qiáng)效的雙泛Ⅰ類PI3K和mTOR抑制劑，通過競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合位點(diǎn)，可逆地抑制PI3K Ⅰ類和mTOR復(fù)合物的催化活性[5]。較mTOR單靶點(diǎn)抑制劑，可消除通路內(nèi)反饋機(jī)制，更有效的抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化，使4E-BP1和eIF-4E、S6K1和eIF-3維持結(jié)合狀態(tài)，抑制翻譯起始復(fù)合物形成，減少DNA修復(fù)過程原料蛋白的合成，以抑制DNA損傷修復(fù)，達(dá)到增加輻射損傷的結(jié)果。

二、NVP-BEZ235抑制非同源末端結(jié)合修復(fù)途徑

非同源末端結(jié)合修復(fù)(NHEJ)途徑是DSB的主要修復(fù)途徑，由以DNA依賴性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)為關(guān)鍵酶的多酶復(fù)合物執(zhí)行，將斷裂的DNA鏈末端連接在一起，可以發(fā)生在細(xì)胞周期中的所有階段。隨著生物進(jìn)化復(fù)雜程度的提高，NHEJ在DDR中所占的比重逐漸增加，因此有效抑制NHEJ途徑對(duì)于抑制DNA損傷修復(fù)作用至關(guān)重要[6]。

DNA-PK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，含有DSB特異性末端結(jié)合蛋白Ku(Ku70/Ku80異源二聚體)和DNA依賴的蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)。當(dāng)DSB發(fā)生時(shí)，Ku蛋白對(duì)DNA末端進(jìn)行識(shí)別，將其穿入蛋白二聚體的孔中，通過Ku80羧基末端結(jié)構(gòu)域?qū)NA-PKcs連接到Ku DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DNA-PKcs在多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸位點(diǎn)被磷酸化激活，進(jìn)一步激活Ku70、Ku80、Artemis、XRCC4、XRCC4樣因子(XRCC4-like factor，XLF)和DNA連接酶Ⅳ(DNA Ligase Ⅳ，Lig4)。XRCC4和XLF具有相似的二聚體結(jié)構(gòu)，在Lig4羧基端的BRCT重復(fù)序列介導(dǎo)下，與Lig4相互作用，將DNA片段進(jìn)行連接。在NHEJ修復(fù)結(jié)束或過程中，Ku蛋白被E3連接酶RNF8泛素化降解。

有研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路中的關(guān)鍵蛋白Akt參與激活DNA-PKcs，進(jìn)而啟動(dòng)NHEJ途經(jīng)[7]。Akt包括Akt1(PKBα)、Akt2(PKBβ)和 Akt3(PKBγ)3個(gè)亞型，其中Akt1亞型在全身廣泛表達(dá)，與輻射誘導(dǎo)后的DNA損傷修復(fù)相關(guān)，是腫瘤的不良預(yù)后因素[8]。經(jīng)輻射誘導(dǎo)，異常激活的PI3K促使磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)磷酸化產(chǎn)生 PIP3，進(jìn)而在Thr殘基磷酸化激活A(yù)kt異構(gòu)體(PKBα-Thr308、PKBβ-Thr309、PKBγ-Thr305)。雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTOR complex 2，mTORC2)在Ser殘基磷酸化Akt異構(gòu)體(PKBα- Ser473、PKBβ- Ser474、PKBγ- Ser472)，使Akt的活性最大化。磷酸化的Akt1促進(jìn)DNA-PKcs與Ku蛋白結(jié)合以及在DNA損傷位點(diǎn)的積累，并使DNA-PKcs于Ser2056位點(diǎn)自磷酸化激活[9]。NVP-BEZ235作為一種PI3K/mTOR雙重抑制劑，同時(shí)作用于PI3K和mTORC2，與單靶PI3K或mTORC1抑制劑比較，Akt的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)均被有效抑制，消除相應(yīng)的反饋機(jī)制，對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路以及下游DNA-PK表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效果，達(dá)到增加輻射損傷的結(jié)果。

另有研究認(rèn)為，Akt與DNA-PKcs的層級(jí)關(guān)系尚存在爭(zhēng)議，DNA-PKcs在Ser473位點(diǎn)磷酸化激活A(yù)kt，反之不然，但NVP-BEZ235仍對(duì)NHEJ途徑表現(xiàn)出有效的抑制作用。Ser2056和Thr2609位點(diǎn)磷酸化是DNA-PKcs表達(dá)激酶活性不可缺少的條件，其中Ser2056由DNA-PKcs進(jìn)行自體磷酸化，Thr2609則由共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變激酶(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)介導(dǎo)磷酸化[10]。DNA-PK和ATM均屬于磷酸?；?激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK)家族，與PI3K高度同源，為PI3K抑制劑同時(shí)抑制DNA-PK、ATM提供了生物學(xué)基礎(chǔ)[11]。由此，NVP-BEZ235可以直接抑制DNA-PK和ATM的活性，從而抑制NHEJ途徑，增加細(xì)胞輻射損傷。

三、NVP-BEZ235抑制同源重組修復(fù)(HR)途徑

同源重組修復(fù)(HR)途徑使用姐妹染色單體作為模板進(jìn)行修復(fù)，是高度保守的DSB修復(fù)方式，發(fā)生在細(xì)胞周期中的S期和G2期。當(dāng)DSB發(fā)生時(shí)，DNA損傷傳感器ATM磷酸化激活，乳腺癌1型易感蛋白(breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1)被ATM直接或通過檢查點(diǎn)激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2)間接磷酸化激活，同時(shí)也可被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases，CDK1)磷酸化激活。BRCA1與CtBP相互作用蛋白(CtBP-interacting protein，CtIP)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地從DSB位點(diǎn)去除p53結(jié)合蛋白1(p53-binding protein 1，53BP1)，將雙鏈DNA切除為兩條3(單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)，復(fù)制蛋白A (replication protein A，RPA)對(duì)ssDNA進(jìn)行快速包被和保護(hù)。BRCA1與BRCA2伴侶及定位蛋白(partner and localizer BRCA2，PALB2)結(jié)合在DSB位點(diǎn)招募乳腺癌2型易感蛋白(breast cancer type 2 susceptibility protein，BRCA2)。繼而將RAD51募集至ssDNA周圍，去除RPA，形成均聚物纖維并連接同源染色單體。DNA聚合酶將損傷DNA的3′端拉長(zhǎng)，然后進(jìn)行DNA連接。

HR途徑在哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中僅占30%左右，然而一些研究認(rèn)為，HR對(duì)細(xì)胞存活的意義較NHEJ更大，這可能是因?yàn)镈SB更容易發(fā)生在G2期，可能是因?yàn)镠R途徑精確的復(fù)制方式，也可能是因?yàn)镠R途徑在DNA復(fù)制中的作用[12]。其中RAD51是HR途徑的核心蛋白，表達(dá)量隨HR途徑周期性變化，在S期和G2期最高[13]。腫瘤細(xì)胞中RAD51高表達(dá)提示預(yù)后不良。在此之外，細(xì)胞復(fù)制過程中，暫時(shí)被解開的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)極易受到核溶解攻擊，同樣可引發(fā)DSB，RAD51在維持復(fù)制叉穩(wěn)定性的過程中起到重要作用，這對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖至關(guān)重要[14]。

BRCA1和BRCA2突變與乳腺癌、結(jié)直腸癌等多個(gè)瘤種易感性相關(guān)，在HR途徑中同樣扮演重要角色[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在輻射誘導(dǎo)下，BRCA1可以抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，減少DSB，并且具有E3連接酶活性，差異性泛素化DNA損傷修復(fù)蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞周期。BRCA2可通過招募RAD51維持DNA復(fù)制叉穩(wěn)定性，保護(hù)端粒完整性，并促進(jìn)HR途徑。BRCA1和BRCA2還在調(diào)控細(xì)胞自噬、基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑等方面發(fā)揮作用[16]。

多項(xiàng)研究在探索PI3K/Akt/mTOR通路對(duì)HR途徑的調(diào)控作用[17]。目前已知，活化的Akt可上調(diào)RAD51表達(dá)，直接磷酸化BRCA1，并促進(jìn)BRCA1-RAD51核定位，激活HR途徑[18]。NVP-BEZ235可通過對(duì)Akt的抑制作用，抑制BRCA1活性，以及BRCA2、RAD51的補(bǔ)充，減少RAD51蛋白合成并損傷其核定位，并由于BRCA1的泛素化作用，間接影響CtIP、γH2AX等蛋白與DNA結(jié)合。如前文所述，ATM屬于PIKK家族，NVP-BEZ235可直接抑制ATM活性，從而抑制HR途徑，增加細(xì)胞輻射損傷。

四、NVP-BEZ235抑制細(xì)胞周期進(jìn)程

在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt/mTOR通路異常激活造成的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失控，使細(xì)胞處于持續(xù)增殖狀態(tài)。當(dāng)DSB發(fā)生時(shí)， ATM激活下游CHK2，然后在Ser216位點(diǎn)磷酸化Cdc25，這是一種蛋白磷酸酶，可以使CDK1于Tyr15位點(diǎn)磷酸化，抑制CDK1/Cyclin B1復(fù)合物活性，使細(xì)胞周期在G2/M檢查點(diǎn)暫時(shí)停滯，為HR途徑提供充分的作用時(shí)間[19]。待DNA損傷修復(fù)完成或耐受，CDK1的Tyr15位點(diǎn)去磷酸化，激活CDK1/Cyclin B1復(fù)合物活性，解除細(xì)胞周期G2期阻滯。

但研究表明，NVP-BEZ235在細(xì)胞G0/G1期表達(dá)出更明顯的放射增敏效果，主要抑制NHEJ途徑[20]。Cyclin D和Cyclin E為G1～S期細(xì)胞周期進(jìn)程的重要調(diào)控因子，由mTOR在翻譯水平上對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，其表達(dá)上調(diào)是腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志。NVP-BEZ235通過抑制mTOR活性，下調(diào)S6K和eIF-4E磷酸化水平，減少Cyclin D和Cyclin E的表達(dá)，并通過糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β)介導(dǎo)，促進(jìn)蛋白降解，使細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。另外，NVP-BEZ235通過抑制Akt活性，上調(diào)下游p21表達(dá)。p21是一種周期蛋白依賴性激酶抑制劑，依賴于GSK3β/β-catenin/p21級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制Cyclin E/Cdk2復(fù)合物活性，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯。

NVP-BEZ235在抑制細(xì)胞增殖能力的同時(shí)，壓縮HR途徑作用時(shí)間，并延長(zhǎng)了利于增加細(xì)胞輻射損傷的細(xì)胞時(shí)相。

五、展 望

綜上所述，在細(xì)胞復(fù)雜的通路網(wǎng)絡(luò)中，存在著多重交互作用。NVP-BEZ235作為PI3K/mTOR雙重抑制劑，可通過對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路的有效抑制作用，下調(diào)NHEJ和HR途徑活性，同時(shí)可由于PIKK家族內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)的相似性，直接抑制NHEJ和HR途徑，增加腫瘤細(xì)胞的輻射損傷。并有研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷修復(fù)途徑的選擇處在動(dòng)態(tài)變化之中，當(dāng)其中一條DNA損傷修復(fù)途徑(NHEJ/HR)被抑制時(shí)，會(huì)出現(xiàn)另一條途徑(HR/NHEJ)的增強(qiáng)。NVP-BEZ235同時(shí)作用于NHEJ和HR途徑中的多個(gè)蛋白靶點(diǎn)，效果優(yōu)于mTOR、DNA-PKcs或ATM單靶點(diǎn)抑制劑，在增加細(xì)胞輻射損傷的探索中展現(xiàn)出更豐富的前景。

目前NVP-BEZ235與放射敏感性相關(guān)的研究尚停留在體外/異種移植瘤階段，僅有數(shù)項(xiàng)與化療敏感度相關(guān)研究進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ期臨床研究階段，且結(jié)果尚不理想，其體內(nèi)作用機(jī)制仍需更多的研究與驗(yàn)證。